Novel approaches for the development of chromo fluorogenic chemosensors for detection of Cu(II) and biothiols

Abstract

[EN] This PhD thesis entitled “Novel approaches for the development of chromofluorogenic chemosensors for detection of Cu(II) and biothiols” is devoted to the synthesis, characterization and coordination behaviour of new chromofluorogenic probes for the recognition and detection of Cu(II) cations and biothiols (glutathione, cysteine and homocysteine). These new probes, which selectively detect Cu(II) cation through colour and/or emission changes, are constructed using a paradigm in which the binding units are included into the signalling unit structure. Besides, some of the Cu(II) complexes of these new probes are used for the chromo-fluorogenic detection of biothiols using displacement reactions. The first chapter of this PhD thesis gives an overview about the conceptual framework in which are located the studies presented in this thesis, which combine concepts related with supramolecular chemistry, optical sensors and molecular probes. In the second chapter, the general objectives of this PhD thesis are presented. The third chapter is devoted to the synthesis and characterization of 4-(4,5- diphenyl-1H-imidazole-2-yl)-N,N-dimethylaniline, a chromo-fluorogenic probe for selective Cu(II) detection in aqueous environment. Water-acetonitrile 1:1 (v/v) solutions of this probe presented a marked absorption band at ca. 320 nm that is selectively red-shifted (to 490 nm reflected in a colour change from colourless to reddish-brown) upon addition of Cu(II) cation. This shift was ascribed to the formation of a non-emissive 1:1 stoichiometry complex in which Cu(II) coordinated with the nitrogen atoms of the imidazole ring. Besides, this Cu(II) complex was used for the selective and sensitive detection of glutathione, which induced the disappearance of the 490 nm absorption with a marked colour change from reddish-brown to colourless. Also a marked emission at 455 nm was observed after glutathione addition. These optical changes were ascribed to a glutathione-induced demetallation process which generated the free probe. In addition, the Cu(II) complex detected glutathione with a remarkable limit of detection as low as 2.0 μM. The fourth chapter presented an imidazole-based probe functionalized with two thiophene subunits for the selective detection of Cu(II) cation and biothiols. Water-acetonitrile 9:1 (v/v) solutions of the free probe showed an absorption band at 320 and a marked emission at 475 nm. Of all the cations tested, only Cu(II) induced an emission quenching with a significant colour change from colourless to deep blue (appearance of a new absorption band centred at 555 nm). These remarkable optical changes were ascribed to the formation of 1:1 stoichiometry complexes in which the metal cation coordinated with the nitrogen atoms of the imidazole heterocycle. Besides, the optical response of the Cu(II) complex was tested in the presence of selected amino acids. Of all the amino acids tested, only glutathione, cysteine and homocysteine induced a marked bleaching of the complex solution with a remarkable growing of an emission band centred at 475 nm. These optical changes were ascribed to a demetallation process induced by the coordination of biothiols with Cu(II). Furthermore, viability assays indicated the non-toxicity of the probe for HeLa cells. Also, the probe was successfully employed to detect Cu(II) in HeLa cells using confocal microscopy. The fifth chapter presented the synthesis and characterization of three probes containing N,N-diphenylanilino (as a donor group) and different π-spacers (benzene and thiophene) connected with aldehyde moieties. Absorption spectra of the three probes in acetonitrile showed an intense absorption band in the UVvisible region (360-420 nm range) which can be attributed to an intramolecular charge-transfer transition as consequence of the presence of N,N-diphenylanilino electron donor moiety directly linked to (hetero)aromatic bridges functionalized with the aldehyde electron acceptor group. Of all the cations tested, only Cu(II) induced the appearance of marked near infrared absorption bands in the 750- 1075 nm interval. Besides, the three probes are moderately emissive (with bands in the 540-580 nm interval) and only Cu(II) cation was able to induce a fluorescence quenching. The optical changes were ascribed to the formation of 1:1 stoichiometry complexes in the which Cu(II) cation probably interacted with the oxygen atom of the aldehyde functional group. Finally, using sodium dodecyl sulfate (20 mM)-acetonitrile 9:1 v/v mixtures, these probes were solubilized and were successfully used for the detection of Cu(II) in aqueous environments. Two 2,4,5-triaryl imidazole probes for the selective recognition of Cu(II) and biothiols were presented in the sixth chapter. Both probes presented marked absorption bands in the UV zone (320-350 nm range) and were moderately emissive in acetonitrile. Of all the cations tested, only Cu(II) induced the appearance of red shifted absorptions and the quenching of the emission bands. Job’s plots indicated the formation of 1:1 stoichiometry complexes in which Cu(II) cation interacted with the nitrogen atoms of the imidazole heterocycle located in the core of both probes. The probe containing furan rings was able to detect Cu(II) in water-acetonitrile 1:1 v/v solutions and the complex formed was also used to detect biothiols in aqueous environment (by marked colour changes and the appearance of a moderate emission). Again, the optical response obtained in the presence of biothiols was ascribed to a demetallation process. Finally, the seventh chapter of this PhD thesis is devoted to the final conclusions and future perspectives that the results presented in this work could open in the field of optical probes for the detection of metal cations and biomolecules in aqueous environments

[ES] Esta tesis doctoral, que lleva por título “Nuevas aproximaciones para el desarrollo de sensores cromo-fluorogénicos para la detección de Cu(II) y biotioles” aborda la síntesis, caracterización y estudio de la capacidad coordinante de nuevos sensores cromo-fluorogénicos para el reconocimiento y la detección del catión Cu(II) y de biotioles (glutatión, cisteína y homocisteína). Estos nuevos sensores, que son capaces de detectar de forma selectiva Cu(II) mediante cambios de color y/o de fluorescencia, están construidos mediante un paradigma que consiste en integrar los grupos coordinantes dentro de la estructura de la unidad indicadora. Además, los complejos de Cu(II) de los nuevos sensores se han empleado para la detección cromo-fluorogénica de biotioles mediante reacciones de desplazamiento. El primer capítulo de esta tesis doctoral está dedicado a la introducción de los conceptos básicos de la química supramolecular, los sensores ópticos y las sondas moleculares, necesarios para entender el marco en el que se encuadran los resultados obtenidos. Por otra parte, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales de esta tesis doctoral. En el tercer capítulo se describe la síntesis y caracterización de compuesto 4- (4,5-difenil-1H-imidazol-2-il)-N,N-dimetilanilina, un sensor cromo-fluorogénico que es capaz de detectar de forma selectiva el catión Cu(II) en medios acuosos. Así, disoluciones del sensor en agua-acetonitrilo 1:1 (v/v) muestran una banda de absorción intensa centrada en 320 nm que es desplazada hacia el rojo (hasta 490 nm) desplazamiento que se ve reflejado en un cambio de color de incoloro a marón-rojizo de forma selectiva al adicionar el catión Cu(II). Este desplazamiento es debido a la formación de un complejo no fluorescente con estequiometría 1:1 donde el Cu(II) coordina con los átomos de nitrógeno del imidazol. Además, este complejo de Cu(II) se ha empleado para la detección selectiva de glutatión ya que este biotiol es capaz de inducir la desaparición de la banda de absorción a 490 nm (asociada a un cambio de color de marrón-rojizo a incoloro). En presencia de glutatión también se produce un aumento de fluorescencia a 455 nm. Estos cambios ópticos son adscritos a un proceso de demetalación del complejo inducido de forma selectiva por el glutatión (la cisteína y la homocisteína son incapaces de producir esta respuesta). Finalmente, el complejo es capaz de detectar glutatión con una alta sensibilidad con un límite de detección de 2,0 μM. En el capítulo cuarto de esta tesis se describe otro sensor óptico basado en el imidazol, en este caso funcionalizado con dos tiofenos, que es capaz de detectar de forma selectiva al catión Cu(II) y biotioles. En este caso disoluciones del sensor en agua-acetonitrilo 9:1 v/v están caracterizadas por la presencia de una banda de absorción a 320 nm y por una fluorescencia intensa a 475 nm. De nuevo, de todos los cationes ensayados, sílo el Cu(II) es capaz de inducir una desactivación completa de la emisión y un cambio de color en la disolución de incoloro a azul asociado con la aparición de una banda desplazada hacia el rojo a 555 nm. Estos cambios de color y de fluorescencia son debidos a la formación de complejos de estequiometría 1:1 en los que el Cu(II) coordina con los átomos de nitrógeno de imidazol. Además, también se estudió la respuesta óptica del complejo de Cu(II) en presencia de aminoácidos. En este caso, solo el glutatión, la cisteína y la homocisteína produjeron una decoloración intensa juntamente con la aparición de una banda de emisión a 475 nm. Estos cambios son debidos a un proceso de demetalación del complejo debido a la coordinación de los biotioles con el catión Cu(II). Teniendo en cuenta una posible aplicación de este sensor para detectar Cu(II) en medios biológicos se comprobó, mediante ensayos de viabilidad, que no presenta toxicidad aparente en células HeLa. Además, mediciones de microscopia confocal demuestran que el sensor puede ser empleado con éxito para detectar Cu(II) en células HeLa. En el quinto capítulo esta tesis doctoral se abordó la síntesis y caracterización de tres sensores conteniendo grupos N,N-difenilanilino (dador de electrones) y diferentes espaciadores π (benceno y tiofeno) conectados con grupos aldehído (aceptor de electrones). Los espectros UV-visible de estos tres receptores en acetonitrilo presentan bandas de absorción (de transferencia de carga debido a la presencia de la agrupación dadora de electrones N,N-difenilanilino conectada con puentes heteroaromáticos conteniendo grupos aldehído electrón aceptores) intensas en el intervalo que va de los 360 a los 420 nm. Se estudió el comportamiento de estos sensores en presencia de cationes y sólo el Cu(II) fue capaz de inducir la aparición de bandas en la zona infrarroja cercana en el intervalo entre 750 y 1075 nm. Además, los tres sensores son poco fluorescentes (con bandas localizadas en el intervalo entre 540 y 580 nm) y sólo el catión Cu(II) es capaz de desactivar la emisión. De nuevo, los cambios ópticos observados son debidos a la formación de complejos de estequiometría 1:1 en los que el catión Cu(II) interacciona con el átomo de oxígeno de los grupos aldehído. Estos sensores se pueden solubilizar en medios acuosos empleando dodecil sulfato. De esta forma, son capaces de detectar Cu(II) en mezclas docedil sulfato (20 mM)- acetonitrilo 9:1 v/v. Dos sensores basados en 2,4,5-triaril imidazol (conteniendo furanos y 1,10- fenantrolina), capaces de detectar Cu(II) y biotioles, se describen en el capítulo sexto. Disoluciones de los dos sensores en acetonitrilo muestran bandas de absorción en el intervalo que va de los 320 a los 350 nm siendo además ligeramente fluorescentes. De todos los cationes empleados en el estudio, sólo el Cu(II) es capaz de inducir la aparición de nuevas bandas de absorción desplazadas hacia el rojo junto con la desactivación de la emisión de los sensores. Estos cambios son asignados a la formación de complejos de estequiometría 1:1 en los que el Cu(II) interacciona con los átomos de nitrógeno del imidazol. El sensor conteniendo furanos es capaz de detectar Cu(II) en agua-acetonitrilo 1:1 v/v y el complejo formado se ha empleado con éxito para detectar biotioles (glutatión, cisteína y homocisteína) mediante cambios de color y aparición de fluorescencia. De nuevo, la respuesta óptica obtenida en presencia de biotioles se debe a un proceso de demetalación del complejo de Cu(II). Finalmente, el capítulo séptimo de esta tesis doctoral está dedicado a las conclusiones finales y a las perspectivas futuras que el trabajo que aquí se expone puede abrir en el campo de los sensores ópticos para la detección de cationes metálicos y biomoléculas en agua o en medios acuosos.

[CA] Aquesta tesi doctoral, que porta per títol “Noves aproximacions per al desenvolupament de sensors cromo-fluorogènics per a la detecció de Cu(II) i biotiols” aborda la síntesi, caracterització i estudi de la capacitat coordinant de nous sensors cromo-fluorogènics per al reconeixement i la detecció del catió Cu(II) i de biotiols (glutatió, cisteïna i homocisteïna). Aquests nous sensors, que són capaços de detectar de forma selectiva Cu(II) mitjançant canvis de color i/o de fluorescència, estan construïts mitjançant un nou paradigma que consisteix a integrar els grups coordinants dins de l'estructura de la unitat indicadora. A més, els complexos de Cu(II) dels nous sensors s'han emprat per a la detecció cromofluorogènica de biotiols mitjançant reaccions de desplaçament. El primer capítol d'aquesta tesi doctoral està dedicat a la introducció dels conceptes bàsics de la química supramolecular, els sensors òptics i les sondes moleculars, necessaris per a entendre el marc en el qual s'enquadren els resultats obtinguts. D'altra banda, en el segon capítol, es presenten els objectius generals d'aquesta tesi doctoral. En el tercer capítol es descriu la síntesi i caracterització de compost 4-(4,5- difenil-1H-imidazol-2-il)-N,N-dimetilanilina, un sensor cromo-fluorogènic que és capaç de detectar de forma selectiva el catió Cu(II) en medis aquosos. Així, dissolucions del sensor en aigua-acetonitril 1:1 (v/v) mostren una banda d'absorció intensa centrada en 320 nm que és desplaçada cap al roig (fins a 490 nm, desplaçament que es veu reflectit en un canvi de color d'incolor a marrórojenc) de forma selectiva en addicionar el catió Cu(II). Aquest desplaçament és degut a la formació d'un complex no fluorescent amb estequiometria 1:1 (en aquest complex el Cu(II) coordina amb els àtoms de nitrogen del imidazol). A més, aquest complex de Cu(II) s'ha emprat per a la detecció selectiva de glutatió ja que aquest biotiol és capaç d'induir la desaparició de la banda d'absorció a 490 nm (associada a un canvi de color de marró-rojenc a incolor). En presència de glutatió també es produeix un augment de fluorescència a 455 nm. Aquests canvis òptics són adscrits a un procés de demetal·lació del complex induït de forma selectiva pel glutatió (la cisteïna i la homocisteïna són incapaces de produir aquesta resposta). Finalment, el complex és capaç de detectar glutatió amb una alta sensibilitat ja que el límit de detecció és 2.0 μM. En el capítol quart d'aquesta tesi es descriu un altre sensor òptic basat en el imidazol, en aquest cas funcionalitzat amb dos tiofens, que és capaç de detectar de forma selectiva al catió Cu(II) i als tres biotiols. En aquest cas dissolucions del sensor en aigua-acetonitril 9:1 v/v estan caracteritzades per la presència d'una banda d'absorció a 320 nm i per una fluorescència intensa a 475 nm. De nou, de tots els cations assajats, només el Cu(II) és capaç d'induir una desactivació completa de l'emissió i un canvi de color en la dissolució d'incolor a blau (associat amb l'aparició d'una banda desplaçada cap al roig a 555 nm). Aquests canvis de color i de fluorescència són deguts a la formació de complexos d'estequiometria 1:1 en els quals el Cu(II) coordina amb els àtoms de nitrogen d'imidazol. A més, també es va estudiar la resposta òptica del complex de Cu(II) en presència d'aminoàcids. En aquest cas, només el glutatió, la cisteïna i l'homocisteïna van produir una descoloració intensa juntament amb l'aparició d'una banda d'emissió a 475 nm. Aquests canvis són deguts a un procés de demetal·lació del complex degut a la coordinació dels biotiols amb el catió Cu(II). Tenint en compte una possible aplicació d'aquest sensor per a detectar Cu(II) en mitjans biològics es va comprovar, mitjançant assajos de viabilitat, que no presenta toxicitat aparent en cèl·lules HeLa. A més, mesures de microscòpia confocal demostren que el sensor pot ser emprat amb èxit per a detectar Cu(II) en cèl·lules HeLa. En el cinquè capítol d'aquesta tesi doctoral, es va abordar la síntesi i caracterització de tres sensors contenint grups N,N-difenilanilino (donador d'electrons) i diferents espaiadors π (benzè i tiofè) connectats amb grups aldehid (acceptor d'electrons). Els espectres UV-visible d'aquests tres receptors en acetonitril presenten bandes d'absorció (de transferència de càrrega a causa de la presència de l'agrupació donadora d'electrons N,N-difenilanilino connectada amb ponts heteroaromàtics contenint grups aldehid electró acceptors) intenses en l'interval que va dels 360 als 420 nm. Es va estudiar el comportament d'aquests sensors en presència de cations i sols el Cu(II) va ser capaç d'induir l'aparició de bandes en la zona infraroja pròxima en l'interval entre 750 i 1075 nm. A més, els tres sensors són poc fluorescents (amb bandes localitzades en l'interval entre 540 i 580 nm) i només el catió Cu(II) és capaç de desactivar l'emissió. De nou, els canvis òptics observats són deguts a la formació de complexos d'estequiometria 1:1 en els quals el catió Cu(II) interacciona amb l'àtom d'oxigen dels grups aldehid. Aquests sensors es poden solubilitzar en medis aquosos emprant dodecil sulfat. D'aquesta forma, són capaços de detectar Cu(II) en mescles docedil sulfat (20 mM)-acetonitril 9:1 v/v. Dos sensors basats en 2,4,5-triaril imidazol (contenint furans i 1,10- fenantrolina), capaços de detectar Cu(II) i biotiols, es descriuen en el capítol sisè. Dissolucions dels dos sensors en acetonitril mostren bandes d'absorció en l'interval que va dels 320 als 350 nm sent a més lleugerament fluorescents. De tots els cations emprats en l'estudi, només el Cu(II) és capaç d'induir l'aparició de noves bandes d'absorció desplaçades cap al roig juntament amb la desactivació de l'emissió dels sensors. Aquests canvis són assignats a la formació de complexos d'estequiometria 1:1 en els quals el Cu(II) interacciona amb els àtoms de nitrogen de l'imidazol. El sensor contenint furans és capaç de detectar Cu(II) en aiguaacetonitril 1:1 v/v i el complex format s'ha emprat amb èxit per a detectar biotiols (glutatió, cisteïna i homocisteïna) mitjançant canvis de color i aparició de fluorescència. De nou, la resposta òptica obtinguda en presència de biotiols es deu a un procés de demetal·lació del complex de Cu(II). Finalment, el capítol setè d'aquesta tesi doctoral està dedicat a les conclusions finals i a les perspectives futures que el treball que ací s'exposa pot obrir en el camp dels sensors òptics per a la detecció de cations metàl·lics i biomolècules en aigua o en medis aquosos.