High-throughput strategies for molecular diagnosis of nonsyndromic inherited retinal dystrophies

Abstract

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos caracterizados por la muerte, generalmente, progresiva de fotorreceptores y células del epitelio pigmentario retiniano. Las DHR afectan a más de 2 millones de personas en el mundo, produciendo una pérdida parcial y, en muchos casos, total de la visión, para la cual no existe ningún tratamiento que revierta o frene la progresión de la enfermedad. Se caracterizan por una elevada heterogeneidad clínica y genética, identificándose hasta la fecha mutaciones en más de 250 genes responsable de algún tipo de DHR. Esta tesis doctoral se ha centrado en el diagnóstico genético de 208 pacientes afectados de DHR no sindrómica (DHR-NS), mediante secuenciación masiva dirigida a un panel de 117 genes y cinco regiones intrónicas profundas en las que previamente se habían descrito mutaciones. Las variantes identificadas en los pacientes se priorizaron de acuerdo a la mínima frecuencia alélica y se clasificaron según los criterios de la guía del American College of Medical Genetics and Genomics. Las variantes de número de copias identificadas mediante la secuenciación del panel se validaron utilizando multiplex ligation-dependent probe amplification o array genómico. A todos los pacientes se les realizó un estudio oftalmológico, más o menos exhaustivo, incluyendo pruebas electrofisiológicas. Además, se realizaron ensayos in vitro con minigenes para comprobar la repercusión de ciertas variantes sobre el procesamiento del ARNm. Para ello, se empleó el plásmido pSPL3 en el que se introdujo la mutación a estudio, la transformación se realizó en bacterias E. coli electrocompetentes y la transfección en células HEK-293. Mediante la secuenciación del panel de genes, se obtuvo una tasa diagnóstica del 60%. Las mutaciones en los pacientes resueltos se distribuyeron en 30 genes diferentes, de las cuales 38 se describen por primera vez en este trabajo. Los genes mutados con mayor frecuencia en estos pacientes fueron ABCA4, USH2A, RPGR y PRPH2. Adicionalmente, se identificaron ocho variantes de número de copias en los genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 y ROM1, demostrando el enorme potencial de estas tecnologías. En total, se reclasificaron el 10% de las familias estudiadas y se observó variabilidad fenotípica intra e inter familiar en pacientes con mutaciones en C1QTNF5, CERKL y PROM1. Además, destacamos que el 50% de las mujeres heterocigotas para RPGR y sintomáticas presentaron retinosis pigmentaria (RP) con asimetría interocular. Asimismo, se identificó un caso con posible digenismo entre los genes CNGA1 y CNGB1, y la duplicación completa de ROM1 en dos familias no relacionadas diagnosticadas de RP. Por otra parte, se han identificado seis familias con mutaciones en dos genes que potencialmente ambos podrían ser la causa de la DHR. En el ensayo funcional mediante minigenes, se observó que seis de las variantes analizadas presentaron un splicing aberrante. Los resultados de esta tesis destacan la utilidad clínica de la secuenciación masiva dirigida para las DHR-NS y la importancia de un examen oftalmológico completo que nos permita establecer nuevas asociaciones genotipo-fenotipo y ampliar el conocimiento de este grupo de enfermedades. Identificar la causa de la enfermedad es esencial para mejorar el manejo del paciente, realizar un asesoramiento genético preciso y beneficiarse de los futuros tratamientos y ensayosclínicos basados en terapia génica.

[CA] Les distròfies hereditàries de la retina (DHR) són un conjunt de trastorns caracteritzats per la mort, generalment, progressiva de fotoreceptors i cèl¿lules de l'epiteli pigmentari retiniano. Les DHR afecten més de 2 milions de persones al món, produint una pèrdua parcial i, en molts casos, total de la visió, per la qual no hi ha cap tractament que revertisca o frene la progressió de la malaltia. Es caracteritzen per una elevada heterogeneïtat clínica i genètica, identificant-se fins a la data mutacions en més de 250 gens responsable d'algun tipus de DHR. Esta tesi doctoral s'ha centrat en el diagnòstic genètic de 208 pacients afectats de DHR no sindròmica (DHR-NS), per mitjà de seqüenciació massiva dirigida a un panell de 117 gens i cinc regions intròniques profundes en les que prèviament s'havien descrit mutacions. Les variants identificades en els pacients es van prioritzar d'acord a la mínima freqüència allèlica i es van classificar segons els criteris de la guia de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Les variants de nombre de còpies identificades per mitjà de la seqüenciació del panell es van validar utilitzant multiplex ligation-dependent probe amplification o array genòmic. A tots els pacients se'ls va realitzar un estudi oftalmològic, més o menys exhaustiu, incloent proves electrofisiològiques. A més, es van realitzar assajos in vitro amb minigens per comprovar la repercussió de certes variants sobre el processament de l'ARNm. Per a això, es va emprar el plasmidi pSPL3 en què es va introduir la mutació a estudi, la transformació es va realitzar en bacteris E. coli electrocompetentes i la transfecció en cèl-lules HEK-293. Per mitjà de la seqüenciació del panell de gens, es va obtindre una taxa diagnòstica del 60%. Les mutacions en els pacients resolts es van distribuir en 30 gens diferents, de les quals 38 es descriuen per primera vegada en este treball. Els gens mutats amb major freqüència en estos pacients van ser ABCA4, USH2A, RPGR i PRPH2. Addicionalment, es van identificar huit variants de nombre de còpies en els gens EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 i ROM1, demostrant l'enorme potencial d'estes tecnologies. En total, es van reclassificar el 10% de les famílies estudiades i es va observar variabilitat fenotípica intra i inter familiar en pacients amb mutacions en C1QTNF5, CERKL i PROM1. A més, destaquem que el 50% de les dones heterozigotes per RPGR i simptomàtiques van presentar retinosi pigmentària (RP) amb asimetria interocular. Així mateix, es va identificar un cas amb possible digenismo entre els gens CNGA1 i CNGB1, i la duplicació completa de ROM1 en dues famílies no relacionades diagnosticades de RP. D'altra banda, s'han identificat sis famílies amb mutacions en dos gens que potencialment ambdós podrien ser la causa de la DHR. En l'assaig funcional per mitjà de minigens, es va observar que sis de les variants analitzades van presentar un splicing aberrant. Els resultats d'esta tesi destaquen la utilitat clínica de la seqüenciació massiva dirigida per a les DHR-NS i la importància d'un examen oftalmològic complet que ens permeta establir noves associacions genotip-fenotip i ampliar el coneixement d'este grup de malalties. Identificar la causa de la malaltia és essencial per millorar el maneig del pacient, realitzar un assessorament genètic precís i beneficiar-se dels tractaments basats en teràpia gènica.

[EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of disorders generally characterized by the progressive death of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells. IRD affect more than 2 million people in the world, producing a partial and, in many cases, total loss of vision, for which there is no treatment that reverses or slows the progression of the disease. They are characterized by a high clinical and genetic heterogeneity, identifying mutations in more than 250 genes responsible for some type of IRD to date. This doctoral thesis has focused on the genetic diagnosis of 208 patients affected by non-syndromic IRD (NS-IRD), through targeted genomic sequencing focuses on a panel of 117 genes and five deep intronic regions in which mutations have previously been identified. The identified variants in patients are prioritized according to the minimum allelic frequency and are classified according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics guide. The copy number variants identified by panel sequencing were validated using multiplex ligation-dependent probe amplification or genomic array. All patients underwent an ophthalmological study, more or less comprehensive, including electrophysiological tests. In addition, in vitro assays with minigenes were performed to verify the impact of certain variants on mRNA processing. To do this, pSPL3 plasmid in which the mutation was introduced was used, the transformation was performed in electrocompetent E. coli bacteria and transfection in HEK-293 cells. By the panel sequencing, a diagnostic rate of 60% was obtained. The mutations in the resolved patients were distributed in 30 different genes, of which 38 were described for the first time in this work. The most frequently mutated genes in these patients were ABCA4, USH2A, RPGR and PRPH2. In addition, eight copy number variants were identified in the genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 and ROM1, that demonstrated the enormous potential of these technologies. In total, 10% of the families studied were reclassified and intra and inter-family phenotypic variability was detected in patients with mutations in C1QTNF5, CERKL and PROM1. In addition, we highlight that 50% of the symptomatic and heterozygous RPGR women showed retinitis pigmentosa (RP) with interocular asymmetry. Likewise, we identified a case with possible digenism between the CNGA1 and CNGB1 genes, and the complete duplication of ROM1 in two unrelated families diagnosed with RP. On the other hand, six families have been identified with mutations in two genes that could potentially be the cause of IRD. Functional assays by minigenes showed that six of the studied variants affected splicing. The results of this thesis highlight the clinical utility of targeted genomic sequencing in IRD and the importance of a complete ophthalmological examination that allows us to establish new genotype-phenotype associations and expand the knowledge of this group of diseases. Identifying the cause of the disease is essential to improve patient management, to perform an accurate genetic counseling and to take advantage of treatments based on gene therapy.