Characterization of cancer stem cells from non-small cell lung cancer

Abstract

[EN] Background: Despite the advances in the molecular characterization of lung cancer, chemoresistance, tumor progression and metastasis make of lung cancer the first cause of death cancer-related worldwide. Cancer stem cells (CSCs) are small subpopulations of stem-like cells with self-renewal, differentiation and tumorigenic properties that constitute a promising target, but remain largely unknown. The aim of this study was to isolate and analyze gene expression of CSCs from lung cancer cell-lines and tumor-tissue from resectable NSCLC patients.

Methods: This study was performed on cells from NSCLC tumor samples and cell lines (H1650, H1993, A549 and PC9) grown in monolayer and as spheroids. The expression of: CSC-markers (CD133, EPCAM1, ALDH1A1, CD166, ABCG2, CD44, MUC1, BMI1); pluripotency (KLF4, OCT4, NANOG, SOX2, MYC, CCND1); cell cycle (CDKN1A, CDKN2A, MDM2, WEE1); invasiveness (CDH1, VIM, SNAI1, MMP2, MMP9, CEACAM5); Notch pathway (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, DLL1, DLL4, HEY1, HES1); Wnt pathway (WNT1, WNT2, WNT3, WNT5A, CTNBB1, DKK1, FZD7) and Hedgehog pathway (SMO, PTCH1, SHH, GLI1) were analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR). Housekeeping genes ACTB, CDKN1B and GUSB were used as endogenous controls for relative expression calculation.

Results: Lung tumorspheres had increased expression of EPCAM1, CD44, ALDH1A1 and CDKN1A (p= 0.028, p= 0.021, p= 0.043 and p= 0.021, respectively) when compared to their paired-adherent cells. In addition, epithelial to mesenquimal transition (EMT) inducer SNAI1 was overexpressed (p= 0.011) in tumorspheres. Regarding Notch pathway, DLL4, NOTCH1 and NOTCH2 showed higher expression in spheroids (p= 0.028, p= 0.038 and p= 0.036, respectively). In Wnt pathway, we found higher expression levels of WNT3, CTNBB1 and GSK3B (p= 0.021, p= 0.008 and p= 0.021, respectively) in lungspheres, whereas the activator of the non-canonical Wnt pathway, WNT5A, tended to be less expressed in spheroids compared to adherent-cultured cells. No significant differences were found in other analyzed genes.

Conclusions: Lung spheroids from cancer cell lines and primary tumors showed increased levels of CSC-markers. Genes related to Notch and Wnt were found to be more expressed in tumorspheres, suggesting these pathways as interesting lung-CSC targets.

[ES] Introducción: A pesar de los avances en la caracterización molecular del cáncer de pulmón, la resistencia a la quimioterapia, la progresión tumoral y la metástasis hacen del mismo la primera causa de muerte debida a cáncer a nivel mundial. Las células madre tumorales (CSC) son pequeñas subpoblaciones de células con capacidad de autorenovación, diferenciación y tumorigenicidad que constituyen una diana terapéutica prometedora, pero cuya caracterización es aún un campo poco explorado. El objetivo de este trabajo es aislar y analizar la expresión génica de CSCs procedentes de líneas celulares de cáncer de pulmón y de tejido tumoral de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) en estadios resecables.

Material y Métodos: El estudio se realizó en líneas celulares (H1650, H1993, A549 and PC9) y muestras tumorales de pacientes resecados con CPNM crecidas en monocapa y en placas de baja adherencia con medio sin suero (tumoresferas). La expresión de marcadores de CSC (CD133, EPCAM1, ALDH1A1, CD166, ABCG2, CD44, MUC1, BMI1), genes de pluripotencia (KLF4, OCT4, NANOG, SOX2, MYC, CCND1), genes reguladores del ciclo celular (CDKN1A, CDKN2A, MDM2, WEE1), genes asociados a metástasis (CDH1, VIM, SNAI1, MMP2, MMP9, CEACAM5); y genes de las vías de señalización Notch (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, DLL1, DLL4, HEY1, HES1); Wnt (WNT1, WNT2, WNT3, WNT5A, CTNBB1, DKK1, FZD7) y Hedgehog (SMO, PTCH1, SHH, GLI1) fue analizada mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), normalizándose frente a la expresión de tres genes controles seleccionados: ACTB, CDKN1B y GUSB , utilizados para el cálculo de la expresión relativa.

Resultados: Las tumoresferas de pulmón presentan una expresión incrementada de EPCAM1, CD44, ALDH1A1 y CDKN1A (p= 0.028, p= 0.021, p= 0.043 and p= 0.021, respectivamente) comparadas con sus correspondientes células crecidas en adherencia. Además, el inductor de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), SNAI1, está sobreexpresado (p= 0.011) en tumoresferas. Los genes de la vía Notch: DLL4, NOTCH1 y NOTCH2 también muestran mayor expresión en esferoides (p= 0.028, p= 0.038 and p= 0.036, respectivamente) que en células crecidas en monocapas. En cuanto a los genes de la ruta de Wnt, se observan mayores niveles de expresión de WNT3, CTNBB1 and GSK3B (p= 0.021, p= 0.008 and p= 0.021, respectivamente) en esferoides, mientras que el activador de la vía no canónica de Wnt, WNT5A, tiende a estar menos expresado en las células cultivadas en suspensión frente a las células cultivadas en adherencia. No se encontraron diferencias significativas en el resto de genes analizados.

Conclusiones: Las tumoresferas de pulmón obtenidas a partir de líneas celulares y tumores primarios de pacientes muestran mayores niveles de marcadores de CSC. Además, genes pertenecientes a las rutas de señalización de Notch y Wnt están mayoritariamente expresados en tumoresferas, sugiriendo estas vías de señalización como dianas potenciales contra las CSC en cáncer de pulmón.