Análisis de expresión de genes en células tumorales circulantes en tumores del tracto gastrointestinal, mediante desarrollo y validación de un ensayo de multiplexado basado en tecnología xMAP de Luminex

Abstract

[ES] En este trabajo se desarrolla y valida un nuevo ensayo para el análisis de la expresión de genes en células tumorales circulantes. Este ensayo se fundamenta en el concepto de biopsia líquida que se basa en buscar marcadores en fluidos biológicos, principalmente en la sangre. La biopsia líquida se centra principalmente en la búsqueda de mutaciones en DNA tumoral circulante, es decir DNA liberado desde el tumor al torrente sanguíneo. La biopsia líquida permite realizar diagnósticos y seguimiento de pacientes con tumores sin la necesidad de realizar biopsias de tejido sólido, las cuales no son totalmente representativas de toda la población de células tumorales y además son muy invasivas. En el campo de la biopsia líquida, la detección y análisis de células tumorales circulantes despierta un gran interés. Estas células están presentes en circulación sanguínea de enfermos con diferentes tipos de tumores debido a que se desprenden del propio tumor. Al presentar un fenotipo distinto al de las células normales su perfil de expresión de genes varía. Por lo tanto, los genes expresados diferencialmente en estas células pueden ser utilizados como marcadores para el diagnóstico de tumores. Pero presentan el problema de que sen encuentran en una baja proporción en la sangre. Además, a la hora de realizar análisis de la expresión de genes, los métodos clásicos como RT-PCR son demasiado laboriosos y costosos. Esto hace que el análisis de expresión de células tumorales circulantes no se pueda trasladar a la clínica. Sin embargo, la tecnología xMAP de Luminex podría ser explotada para solventar estos problemas. Esta tecnología se basa en el uso de nanopartículas a las cuales se pueden acoplar reacciones de PCR e inmunoensayos. Estas nanopartículas son marcadas con una fluorescencia específica para cada uno de los marcadores que se quiere analizar, esto permite un análisis simultaneo de diferentes marcadores en el mismo experimento de forma eficiente y con una gran sensibilidad. Para el análisis de la expresión de genes, se acopla a cada nanopartícula una reacción de RT-qPCR específica para cada gen cuya expresión se quiere medir. El desarrollos y validación de este ensayo, se centra en tumores del tracto gastrointestinal: estómago, páncreas, colon y recto. Para ello se seleccionan genes que presentan una sobreexpresión en este tipo de tumores haciendo uso de bases de datos como GEPIA y TCGA. Seguidamente se pasa a validar la eficiencia y especificidad de los primers que permitirán medir la expresión de cada gen, todo ello en líneas celulares. Una vez hecho esto se mide la expresión de estos genes en muestras de sangre de individuos sanos como control negativo. Con los primers generados se generan las nanopartículas para el ensayo y se testan en líneas celulares. Finalmente se pone a punto un protocolo para tratar las muestras de sangre para el enriquecimiento de las células tumorales circulantes y extraer su RNA para el análisis de expresión con las nanopartículas.

[EN] This paper develops and validates a new assay for the analysis of gene expression in circulating tumor cells. This assay uses the concept of liquid biopsy that is based on looking for markers in biological fluids, mainly in the blood. Liquid biopsy mainly focuses on the search for mutations in circulating tumor DNA, that is, DNA released from the tumor into the bloodstream. Liquid biopsy allows diagnoses and monitoring of patients with tumors without the need to perform solid tissue biopsies, which are not fully representative of the entire population of tumor cells and are also very invasive.

In the field of liquid biopsy, the detection and analysis of circulating tumor cells arouses great interest. These cells are present in the bloodstream of patients with different types of tumors because they detach from the tumor itself. By presenting a different phenotype than normal cells, their gene expression profile varies. Therefore, differentially expressed genes in these cells can be used as markers for the diagnosis of tumors. But they present the problem that they find in a low proportion in the blood. In addition, when conducting gene expression analysis, classical methods such as RT-PCR are too laborious and expensive. This means that the expression analysis of circulating tumor cells cannot be transferred to the clinic. However, Luminex xMAP technology could be exploited to solve these problems. This technology is based on the use of nanoparticles to which PCR reactions and immunoassays can be coupled. These nanoparticles are marked with a specific fluorescence for each of the markers to be analyzed, this allows a simultaneous analysis of different markers in the same experiment efficiently and with great sensitivity. For the analysis of gene expression, a specific RT-qPCR reaction is coupled to each nanoparticle. The development and validation of this trial focuses on tumors of the gastrointestinal tract: stomach, pancreas, colon and rectum. For this, genes that have overexpression in this type of tumors are selected using databases such as GEPIA and TCGA. Next, the efficiency and specificity of the primers that will measure the expression of each gene, all in cell lines, will be validated. Once this is done, the expression of these genes in blood samples of healthy individuals is measured as a negative control. With the generated primers, the nanoparticles for the assay are generated and tested on cell lines. Finally, a protocol is developed to treat blood samples for the enrichment of circulating tumor cells and extract their RNA for expression analysis with nanoparticles.