Caracterización de una plataforma electroactiva de hidrogel-microesferas para la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales

Abstract

[ES] El hueso es un tejido muy heterogéneo, por lo que crear una plataforma de cultivo que imite su entorno es un gran desafío. El hueso es un tejido piezoeléctrico y esta propiedad la producen las fibras de colágeno que forman su matriz extracelular. Este estudio se basa en la hipótesis de que la estimulación eléctrica, como ocurre en el tejido nativo, es un factor clave en la diferenciación de las células madre mesenquimales hacia el linaje osteogénico. Además, un entorno tridimensional recreará más eficazmente las condiciones in vivo que uno bidimensional. Por este motivo, nuestra propuesta consiste en un entorno tridimensional, un hidrogel de gelatina en el que embeberemos microesferas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), con y sin nanopartículas magnetostrictivas (ferrita de cobalto - CFO) y células madre mesenquimales de la médula ósea humanas (hMSC). La estimulación magnética externa producirá la deformación de las nanopartículas, deformando la matriz de PVDF y produciendo una señal eléctrica, que estimulará la diferenciación de las hMSC hacia el linaje osteogénico. El PVDF es un polímero semicristalino del que nos interesa obtener el máximo porcentaje de fase ß, su fase más electroactiva. Las microesferas de PVDF se obtuvieron mediante la técnica de electrospray y se caracterizaron físico-químicamente. Para obtener el porcentaje de fases ¿ y ß contenidas en las microesferas utilizamos la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Asimismo, para determinar el grado de cristalinidad del polímero sintetizado utilizamos la calorimetría diferencial de barrido (DSC). El magnetómetro de muestra vibratoria (VSM) fue elegido para medir las propiedades magnéticas obtenidas, más específicamente, el grado de CFO contenido en las microesferas de PVDF-CFO sintetizadas. Además, para comprobar la distribución de las nanopartículas de CFO dentro de las microesferas de PVDF-CFO, se empleó el cañón de iones focalizados (FIB). Finalmente, para la caracterización superficial y espacial de las microesferas, éstas se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM). Por otro lado, para caracterizar el hidrogel empleado en este estudio, realizamos crio-secciones para confirmar la distribución homogénea de las microesferas en ellos. Se cultivaron hMSC dentro del constructo 3D para comprobar la citotoxicidad del biomaterial. La proliferación de las hMSC se estudió a 1, 3 y 7 días mediante el ensayo MTS (4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio). Después de probar que el constructo 3D no resulta citotóxico para las células, se cultivaron hMSC estimuladas por un campo magnético para comprobar cómo este afecta a la proliferación celular. La proliferación de las hMSC se estudió a 1 y 3 días también mediante el ensayo MTS (4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio).

[EN] Bone is a highly heterogeneous tissue, therefore creating a culture platform that mimics its environment is a great challenge. Bone is a piezoelectric tissue and this property is produced by the collagen fibres that form its extracellular matrix. This study is based on the hypothesis that electrical stimulation, as occurs in native tissue, is a key factor in mesenchymal stem cell differentiation towards the osteogenic lineage. Moreover, a three-dimensional environment will more effectively recreate in vivo conditions than a two-dimensional one. For this reason, our proposal consists of a three-dimensional environment, a gelatin hydrogel in which we will embed poly(vinylidene fluoride) (PVDF) microspheres, with and without magnetostrictive nanoparticles (cobalt ferrite - CFO) and human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs). External magnetic stimulation will produce nanoparticles deformation, deforming the PVDF matrix and producing an electrical signal, which will stimulate hMSC differentiation towards the osteogenic linage. PVDF is a semi-crystalline polymer from which we are interested in obtaining the maximum percentage of ß phase, its most electroactive one. PVDF microspheres were obtained using electrospray technique and were physico-chemically characterized. To obtain the percentage of ¿ and ß phases contained in the microspheres we used Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Likewise, to determine the degree of crystallinity of the synthesized polymer we used differential scanning calorimetry (DSC). The vibrating-sample magnetometer (VSM) was chosen to measure the magnetic properties obtained, more specifically, the degree of CFO contained in the synthesized PVDF-CFO microspheres. Also, the focused ion beam was used to check the distribution of the nanoparticles of CFO inside the PVDF-CFO microspheres. Finally, for the surface and spatial characterization of the microspheres, they were visualized using field emission scanning electron microscopy (FESEM) On the other hand, to characterize the hydrogel involved in this study, cryogenic slices were performed to confirm the homogeneous distribution of the microspheres in them. hMSC were cultured within the 3D construct, to check the cytotoxicity of the biomaterial. hMSC proliferation was studied at 1, 3 and 7 days, by MTS assay (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium). After proving the non-cytotoxicity of the 3D construct, hMSC were cultured within it to check if the magnetic field affects cell proliferation. hMSC proliferation was studied at 1 and 3 days by MTS assay (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium).