Competence of oviductal and uterine Extracellular Vesicles in sequential culture of in vitro bovine embryos

Abstract

[EN] In vitro embryo production (IVP) is a biotechnology applied to improve animal reproductive performance, efficiency and genetic gain. The primary focus of IVP is to maximize the number of offspring from genetically superior animals and disseminate germplasm worldwide. Despite the fact that IVP is used commercially successfully, it still has some limiting factors for cost reduction and greater dissemination related to the lower quality of the embryos generated in vitro and the consequent greater sensitivity to cryopreservation. It is known that embryo-maternal communication that occurs before implantation plays a vital role in the establishment and maintenance of pregnancy in mammals, so it is necessary to imitate what happens during this communication in in vitro cultures to improve the quality of the obtained embryos. This maternal-embryonic communication is mediated by various growth factors and molecular signaling pathways between the oviduct, the uterus and the embryo, which affect its development in the short and long term. Small particles called extracellular vesicles (EVs), released naturally by cells and containing various products such as proteins and RNAs among other molecules, play an important role in this interaction. Currently, it is still unknown how they work and how they affect the embryo in vivo or in vitro, but it has already been observed that embryos are capable of capturing these EVs. Therefore, the objective of this study was to isolate and characterize the EVs of the oviductal and uterine fluids and to evaluate their effects in an in vitro sequential culture system on the development and quality of bovine embryos. For this, bovine zygotes were cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) supplemented with 3 mg/ ml BSA or 5% serum depleted of EVs in the presence or absence of 3x105 EVs of the oviductal (Day 1-4) and uterine fluids (Day 4-9), mimicking the physiological conditions of early embryonic development in vivo. Pooled EVs from five oviducts (early-luteal phase) and five uterine horns (early-mid-luteal phase) from slaughtered heifers were isolated using the size exclusion chromatography kit (Hansa BioMed). The size and concentration of the EVs were evaluated by means of a nanotracking analysis system (NTA) and their morphology by transmission electron microscopy (TEM). Cleavage rate and blastocyst yield was recorded on day 2 and days 7 to 9 respectively. On day 7/8 day blastocyst quality was evaluated by staining with Hoechst 33342 for total number of cells, Bodipy 493/503 for lipid content, Mitotracker Deep Red for mitochondrial activity and survival rate after vitrification/warming. The The concentration of EVs was 2.97x1010 and 7.98x1010 particles/ml, and the mean size of 177.5 and 216.5 nm for the oviductal (OF) and uterine fluids (UF), respectively. Through TEM we confirmed the presence of exosomes among EVs, showing the typical cup-shaped morphology. Western blotting confirmed the expression of classic EVs markers described for exosomes such as CD9 and CD63 tetraspanins and HSP70. Our results showed that supplementation of culture media with EVs from OF and UF has no effect on embryo development. However, their use had a positive effect on the quality of the produced embryos giving rise to blastocysts with a greater number of cells, lower lipid content and greater mitochondrial activity. In contrary the survival rate after vitrification / warming was not affected by the use of EVs in culture. In conclusion, mimicking physiological conditions using EVs from OF and UF in a sequential in vitro culture does not affect embryo development, but improves embryo quality by increasing total cell number, decreasing lipid content, and increasing mitochondrial activity. These results evidenced the association of the reproductive tract environment with the development of the early embryo, which confirms the maternal-embryonic communication.

[ES] La producción de embriones in vitro (PIV) es una biotecnología aplicada para mejorar el rendimiento reproductivo, la eficiencia productiva y la ganancia genética animal. El objetivo principal de la PIV es maximizar el número de descendientes de animales genéticamente superiores y diseminar germoplasma en todo el mundo. A pesar de que la PIV se usa comercialmente con éxito, todavía tiene algunos factores limitantes para la reducción de costos y una mayor difusión, relacionados con la menor calidad de los embriones generados in vitro y la consecuente mayor sensibilidad a la criopreservación. Se sabe que la comunicación materno-embrionaria que ocurre antes de la implantación juega un papel vital en el establecimiento y mantenimiento del embarazo en mamíferos, por lo que es necesario imitar lo que sucede durante esta comunicación en cultivos in vitro para mejorar la calidad de los embriones obtenidos. Esta comunicación maternoembrionaria está mediada por varios factores de crecimiento y vías de señalización molecular entre el oviducto, el útero y el embrión, que afectan su desarrollo a corto y largo plazo. Pequeñas partículas llamadas vesículas extracelulares (EVs), liberadas naturalmente por las células contienen diversos productos como proteínas y ARN entre otras moléculas, juegan un papel importante en esta interacción. Actualmente, aún se desconoce cómo funcionan y cómo afectan al embrión in vivo o in vitro, pero ya se ha observado que los embriones son capaces de capturar estas EVs. Es por eso que el objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar las EVs de los fluidos oviductal y uterino y evaluar su efecto en un sistema de cultivo in vitro secuencial sobre el desarrollo y la calidad de los embriones bovinos. Para esto, los cigotos bovinos se cultivaron en fluido oviductal sintético (SOF) suplementado con 3 mg / ml de BSA o 5% de suero depletado de 5% de EVs en presencia o ausencia de 3x105 EVs de los fluidos oviductales (Día 1-4) y uterino. (Día 4-9), imitando las condiciones fisiológicas del desarrollo embrionario temprano in vivo. Las EVs agrupadas de cinco oviductos (fase lútea temprana) y cinco cuernos uterinos (fase lútea temprana media) de vaquillas sacrificadas se aislaron utilizando el kit de cromatografía de exclusión por tamaño (Hansa BioMed). El tamaño y la concentración de las EVs se evaluaron por medio de un sistema de análisis de nanotracking (NTA) y la morfología por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La tasa de división y el rendimiento de blastocito se registraron el día 2 y los días 7 a 9, respectivamente. El día 7/8 días se evaluó la calidad del blastocito mediante tinción con Hoechst 33342 para el número total de células, Bodipy 493/503 para el contenido de lípidos, Mitotracker Deep Red para la actividad mitocondrial y la tasa de supervivencia después de la vitrificación / calentamiento. La concentración de EVs fue de 2.97x1010 y 7.98x1010 partículas / ml, y el tamaño medio fue de 177.5 y 216.5 nm para el fluido oviductal (OF) y el fluido uterino (UF), respectivamente. A través de TEM confirmamos la presencia de EVs, mostrando la típica morfología en forma de copa. El Western Blott confirmó la expresión de marcadores de EVs clásicos descritos para exosomas tales como tetraspaninas CD9 y CD63 y HSP70. Nuestros resultados mostraron que la suplementación de medios de cultivo con EVs de OF y UF no tiene ningún efecto en el desarrollo embrionario. Sin embargo, su uso tuvo un efecto positivo en la calidad de los embriones producidos, dando lugar a blastocitos con un mayor número de células, un menor contenido de lípidos y una mayor actividad mitocondrial. Por el contrario, la tasa de supervivencia después de la vitrificación / calentamiento no se vio afectada por el uso de EVs en el cultivo. En conclusión, imitar las condiciones fisiológicas usando EVs de OF y UF en un cultivo in vitro secuencial no afecta el desarrollo del embrión, pero mejora la calidad del embrión al aumentar el número total de células, disminuir el contenido de lípidos y aumentar la actividad mitocondrial. Estos resultados evidenciaron la asociación del ambiente del tracto reproductivo con el desarrollo del embrión temprano, lo que confirma la comunicación materno-embrionaria.

[CA] La producció d'embrions in vitro (PIV) és una biotecnologia aplicada per a millorar el rendiment reproductiu, l'eficiència productiva i el guany genètic animal. L'objectiu principal de la PIV és maximitzar el numere de descendents d'animals genèticament superiors i disseminar germoplasma a tot el món. A pesar que la PIV s'usa comercialment amb èxit, encara té alguns factors limitants per a la reducció de costos i una major difusió, relacionats amb la menor qualitat dels embrions generats in vitro i la conseqüent major sensibilitat a la criopreservació. Se sap que la comunicació matern-embrionària que ocorre abans de la implantació juga un paper vital en l'establiment i manteniment de l'embaràs en mamífers, per la qual cosa és necessari imitar el que succeeix durant aquesta comunicació en cultius in vitro per a millorar la qualitat dels embrions obtinguts. Aquesta comunicació matern-embrionària està mediada per diversos factors de creixement i vies de senyalització molecular entre l'oviducte, l'úter i l'embrió, que afecten el seu desenvolupament a curt i llarg termini. Xicotetes partícules anomenades vesícules extracelul·lars (EVs), alliberades naturalment per les cèl·lules contenen diversos productes com a proteïnes i ARN entre altres molècules, juguen un paper important en aquesta interacció. Actualment, encara es desconeix com funcionen i com afecten l'embrió in vivo o in vitro, però ja s'ha observat que els embrions són capaços de capturar aquestes EVs. És per això que l'objectiu d'aquest estudi va ser aïllar i caracteritzar les EVs dels fluids oviductal i uterí i avaluar el seu efecte en un sistema de cultiu in vitro seqüencial sobre el desenvolupament i la qualitat dels embrions bovins. Per a això, els zigots bovins es van cultivar en fluid oviductal sintètic (SOF) suplementado amb 3 mg / ml de BSA o 5% de sèrum depletado de 5% d'EVs en presència o absència de 3x105 EVs dels fluids oviductales (Dia 1-4) i uterí. (Dia 4-9), imitant les condicions fisiològiques del desenvolupament embrionari primerenc in vivo. Les EVs agrupades de cinc oviductes (fase lútia primerenca) i cinc banyes uterines (fase lútia primerenca mitjana) de vaquillas sacrificades es van aïllar utilitzant el kit de cromatografia d'exclusió per grandària (Hansa BioMed). La grandària i la concentració de les EVs es van avaluar per mitjà d'un sistema d'anàlisi de nanotracking (NTA) i la morfologia per microscòpia electrònica de transmissió (TEM). La taxa de divisió i el rendiment de blastocito es van registrar el dia 2 i els dies 7 a 9, respectivament. El dia 7/8 dies es va avaluar la qualitat del blastocito mitjançant tinció amb Hoechst 33342 per al nombre total de cèl·lules, Bodipy 493/503 per al contingut de lípids, Mitotracker Deep Red per a l'activitat mitocondrial i la taxa de supervivència després de la vitrificació / calfament. La concentració d'EVs va ser de 2.97x1010 i 7.98x1010 partícules / ml, i la grandària mitjana va ser de 177.5 i 216.5 nm per al fluid oviductal (OF) i el fluid uterí (UF), respectivament. A través de TEM confirmem la presència d'EVs, mostrant la típica morfologia en forma de copa. El Western Blott va confirmar l'expressió de marcadors d'EVs clàssics descrits per a exosomas com ara tetraspaninas CD9 i CD63 i HSP70. Els nostres resultats van mostrar que la suplementació de mitjans de cultiu amb EVs de OF i UF no té cap efecte en el desenvolupament embrionari. No obstant això, el seu ús va tindre un efecte positiu en la qualitat dels embrions produïts, donant lloc a blastocitos amb un major nombre de cèl·lules, un menor contingut de lípids i una major activitat mitocondrial. Per contra, la taxa de supervivència després de la vitrificació / calfament no es va veure afectada per l'ús d'EVs en el cultiu. En conclusió, imitar les condicions fisiològiques usant EVs de OF i UF en un cultiu in vitro seqüencial no afecta el desenvolupament de l'embrió, però millora la qualitat de l'embrió en augmentar el nombre total de cèl·lules, disminuir el contingut de lípids i augmentar l'activitat mitocondrial. Aquests resultats van evidenciar l'associació de l'ambient del tracte reproductiu amb el desenvolupament de l'embrió primerenc, la qual cosa confirma la comunicació matern-embrionària.