Evaluation of sperm methylation as indicator of germ line alterations after successive applications of a cryopreservation program in Oryctolagus cuniculus

Abstract

[EN] The embryo early vitrification and itssubsequent transfer is one of most common Assisted Reproductive Technologies (ART). This technology has allowed to improve the reproductive efficiency, crossbreeding and germplasm preservation programs. Multiple studies in livestock animals, even in humans, have demonstrated a set of alterations in both pre- and postnatal level, and the possible inheritance of these modifications in following generations. Preimplantation embryo is a critical period, since is when most of epigenetic reprogramming take place, and the early embryo vitrification could be modifying this methylation pattern. Therefore, the aim of the current work was to evaluate the accumulative effects of two consecutive embryo vitrification procedures on rabbit (Oryctolagus cuniculus) embryo survival rate, rabbit sperm traits and epigenome profile, and analyse its possible inheritance. To this end, two populations were developed: vitrified embryos transferred to surrogated mother (VT) and naturally-conceived animals (NC) through two generations. All the descendants who were born were healthy, supported by the haematological analysis, and ejaculates from VT group did not show reproductive effectiveness differences respect to NC group. Nevertheless, a 31% decrease of survival rate from first to second generation was registered, indicating a possible negative accumulative effect as consequence of successive cryopreservation. When the sperm epigenome profile was analysed, revealed a level of methylation higher in gene body than promoter regions. No difference were observed between NC and VT groups in the same generation, but a second round of vitrification (VT_G1 vs VT_G2) registered a higher level of methylation in all the regions of interested (ROI) analysed. A total of 1049 and 987 differentially methylated regions (DMRs) were obtained in G1 and G2, respectively. The functional analysis revealed enriched altered Go Terms in relation to protein metabolism, carbohydrate binding and oxidative phosphorylation. From those 1049, 387 remained altered in both generations, suggesting a possible intergenerational transmission of epigenetic marks as a consequence of embryo cryopreservation procedure. In summary, even no differences in health or sperm quality were observed, an accumulative decrease of survival rate was reported after two rounds of cryopreservation. Additionally, a set of DMR were altered in both generations what could be indicating that the embryo cryopreservation is imprinting an epigenetic mark in the germinal cell, with consequence in the reproductive traits.

[ES] La vitrificación de embriones y su posterior transferencia se utilizan ampliamente entre las tecnologías de reproducción asistida (ART) en la producción ganadera. Este procedimiento permite mejorar la eficiencia reproductiva, los cruzamientos y los programas de conservación del germoplasma. Lejos de considerarse neutral, debido a los múltiples estudios en animales de granja que han demostrado que la manipulación de embriones ha alegado muchos resultados adversos a nivel pre- y postnatal, se ha demostrado la posible herencia de los fenotipos adversos. Embriones preimplantacionales se encuentran en un período crítico, ya que es cuando la mayor parte de la reprogramación epigenética tiene lugar. Además, la vitrificación embrionaria temprana podría promover muchos patrones alterados de metilación, considerados marcas epigenéticas. Por lo tanto, el objetivo del trabajo actual será evaluar los efectos acumulados de dos consecutivos procesos de vitrificación embrionaria sobre la tasa de supervivencia de embriones de conejo (Oryctolagus cuniculus), las características del esperma de conejo y su perfil epigenético, y su posible transmisión a lo largo de dos generaciones. Para este fin, se desarrollaron dos poblaciones: embriones vitrificados y transferidos a la madre de acogida (VT) y animales concebidos naturalmente (NC). Al nacer, fue calculada la tasa de supervivencia del embrión y un descenso de la supervivencia en la segunda generación fue demostrado. Todos los descendientes que nacieron estaban sanos, respaldados por el análisis hematológico, y la eyaculación del grupo VT no mostró diferencias de efectividad reproductiva con respecto al grupo NC. Esta falta de diferencias podría deberse a la plasticidad fenotípica. El perfil epigenético del esperma en edad adulta fue evaluado y considerando la densidad de metilación en las regiones genéticas, el nivel de metilación en el cuerpo del gen es más elevada que en el promotor. Además, diferencias epigenéticas entre animales VT y NC en el metabolismo de las proteínas, la unión a carbohidratos y la fosforilación oxidativa se han registrado en ambas generaciones, lo que puede contribuir en las alteraciones reproductivas observadas. Los hallazgos actuales sugieren que la criopreservación de embriones, como programa de preservación del germoplasma, puede promover consecuencias adversas sobre la tasa de supervivencia de embriones, correlacionadas con alteraciones moleculares a nivel epigenético en las células germinales parentales, que podrían afectar a las generaciones venideras.