Optimización de las condiciones de cultivo in vitro de anteras de pimiento dulce

Abstract

[ES] La obtención de líneas puras es un proceso de gran relevancia para la industria agronómica, pues a partir de su cruce, se pueden obtener híbridos comerciales de mayor rendimiento y homogeneidad en la producción. La mejora genética convencional permite obtener líneas puras tras siete u ocho generaciones de autofecundación, proceso demasiado largo y costoso. Por consiguiente, la obtención de dichas líneas conlleva la utilización de técnicas biotecnológicas si se desea ahorrar tiempo y costes de producción, con el fin de obtener individuos haploides y dobles haploides. Una de estas técnicas, denominada androgénesis, consiste en la regeneración de individuos haploides que han sido inducidos a partir del precursor del gametófito masculino, la microspora. En determinadas condiciones de estrés abiótico dichas células haploides se pueden inducir a proliferar y después duplicar su genoma, generando individuos dobles haploides, los cuales son interesantes porque son homocigotos para todos sus loci, por lo que pueden utilizarse como líneas puras. En el caso del pimiento destacan dos técnicas de obtención de dobles haploides: el cultivo de microsporas en medio líquido y el cultivo in vitro de anteras. La ventaja del cultivo de anteras frente al de microsporas es que las células están protegidas por la pared de la antera durante el cultivo, proporcionándole nutrientes y un ambiente más propicio para la inducción de haploides. No obstante, ambas técnicas no están aún optimizadas y presentan aún problemas de rendimiento en la obtención de embriones viables haploides o doble haploides en algunas variedades de pimiento. En este trabajo se han probado distintos medios de cultivo con el objetivo de optimizar el protocolo de obtención de dobles haploides a partir de anteras. Se trata, por lo tanto, de modificar las condiciones de estrés y posterior cultivo a las que se ven sometidas las microsporas para que tenga lugar la división celular y la proliferación que precede a la obtención de haploides y dobles haploides. Entre los factores analizados podemos mencionar la adición de maltosa o nitrato de plata al medio de cultivo, y modificación de la temperatura de incubación. Asimismo, se evalúan los efectos de cada tratamiento sobre las anteras y el número de embriones generados.

[EN] Obtaining pure lines is a highly relevant process for the agronomic industry, since from their crossing, commercial hybrids of high yield and homogeneity in production can be obtained. Conventional plant breeding allows for the production of pure lines after seven or eight generations of self-fertilization, which is remarkably expensive and timeconsuming. Alternatively these lines can be obtained by using biotechnological approaches based on the production of haploids and doubled haploids, which save time and production costs. One of these approaches, known as induction of androgenesis consists in the regeneration of haploid individuals that have been induced from the precursor of the male gametophyte, the microspore. Under certain conditions of abiotic stress, haploid cells can be induced to proliferate and then duplicate their genome, generating doubled haploid individuals, which are interesting because they are homozygous for all of their loci, so they can be used as pure lines. In the case of pepper, two techniques for obtaining doubled haploids stand out: culture of microspores in liquid medium and in vitro culture of anthers. The advantage of anther culture compared to microspore culture is that the cells are protected by the anther wall during culture, providing them with nutrients and an environment more favorable to haploid induction. However, both techniques are not yet optimized and still present performance problems when applied to obtain viable haploid or doubled haploid embryos in some pepper varieties. In this work, different culture media have been tested in order to optimize the protocol for obtaining doubled haploids from anthers. We tried to modify the stress conditions and subsequent in vitro culture to which the microspores are subjected, in order to promote the initial cell division and proliferation that takes place as a consequence of induction. The factors analyzed include the addition of maltose or silver nitrate to the culture medium, and modification of the incubation temperature. Likewise, the effects of each treatment on the anthers and the number of embryos generated are evaluated.