Desarrollo de nuevos nanodispositivos terapéuticos aplicados al tratamiento de enfermedades relacionadas con procesos de senescencia

Abstract

[ES] La presente tesis doctoral, titulada “Desarrollo de nuevos nanodispositivos terapéuticos aplicados al tratamiento de enfermedades relacionadas con procesos de senescencia”, está centrada en el diseño, preparación, caracterización y evaluación funcional (tanto in vitro como in vivo en diferentes modelos celulares y murinos) de un conjunto de nanomateriales híbridos orgánico-inorgánicos, basado en nanopartículas mesoporosas de sílice que llevan por cargo moléculas fluorescentes o terapéuticas y que están funcionalizadas con galacto-sacáridos. Estos galacto-sacáridos actúan como puerta molecular, y son los responsables de controlar la liberación de las moléculas encapsuladas de manera selectiva en células senescentes. En el primer Capítulo, correspondiente a la Introducción, se presenta el escenario biológico sobre el cual se basa esta tesis, la senescencia. También se presentan los diferentes conceptos relacionados con la nanomedicina, los materiales mesoporosos, las puertas moleculares y la liberación controlada de fármacos, así como la interacción de las nanopartículas con las células y el organismo y su posible aplicación como terapia. A continuación, en el segundo Capítulo, se exponen los objetivos generales de la presente tesis doctoral así como los objetivos concretos que se abordarán en los diferentes Capítulos experimentales. El tercer Capítulo recoge el proceso de síntesis y de caracterización estructural y funcional in vitro de las nanopartículas para liberación controlada en células senescentes. En este apartado se presenta el diseño del nanodispositivo y se describen los diferentes sólidos con los que se trabaja en el resto de Capítulos. La diferencia entre ellos radica en la carga encapsulada, puesto que se preparan nanopartículas cargadas con diferentes fluoróforos (para fines de detección) y nanopartículas cargadas con diferentes fármacos (para fines terapéuticos). En todos los casos el sistema está funcionalizado con un galacto-hexa-sacárido que actúa como puerta molecular. Se describen además las diferentes técnicas de caracterización estándar, como estudios de difracción de rayos X, microscopía de transmisión electrónica, etc. Una vez caracterizados los diferentes sólidos, y habiéndose validado el correcto funcionamiento de la puerta molecular en presencia del estímulo de β galactosidasa, se procede a estudiar el comportamiento del sistema en modelos tanto celulares como murinos de diferentes enfermedades relacionadas con procesos de senescencia. Así pues, en el cuarto Capítulo se describe en primer lugar cómo el sistema cargado con el fluoróforo rodamina B es capaz de liberar preferencialmente su cargo en células senescentes, tanto en cultivo celular como en modelo in vivo de ratón. A continuación se presenta un modelo de cáncer en el que el fármaco citotóxico encapsulado en las nanopartículas – concretamente la doxorrubicina – llega a las células tumorales diana en las que previamente se ha inducido senescencia con palbociclib y contribuye a la regresión del tumor. También se describe la validación de estas nanopartículas citotóxicas en un modelo de fibrosis pulmonar, en el que se demuestra que el sistema llega y elimina selectivamente las células senescentes que se acumulan como consecuencia de la enfermedad, consiguiendo así restaurar la función pulmonar. En ambos modelos se demuestra además que la encapsulación consigue reducir los efectos secundarios de la doxorrubicina, entre los que cabe destacar la cardiotoxicidad. Por tanto en este Capítulo no sólo se presenta una estrategia basada en nanoterapia que podría utilizarse como tratamiento para eliminar de manera selectiva células senescentes, sino que también se describe un sistema versátil que podría utilizarse para diagnóstico por imagen clínica encapsulando trazadores o agentes de contraste. En base a los resultados obtenidos en los modelos de melanoma y de fibrosis pulmonar, en el quinto Capítulo se describe la combinación de senogénesis (inducción de senescencia con palbociclib) y senolisis dirigida mediante nanoformulación en un modelo ortotópico de cáncer de mama triple negativo. Las nanopartículas específicas para células senescentes están cargadas en este caso con el fármaco senolítico navitoclax, cuyo uso en clínica actualmente no está aprobado debido a los efectos secundarios que provoca en el organismo. En este trabajo se ha visto que el fármaco palbociclib es capaz de inducir senescencia en un modelo de cáncer de mama triple negativo y negativo para el receptor de andrógenos, un subgrupo para al que hasta ahora no se había descrito sensibilidad. La combinación de la inducción de senescencia con el posterior tratamiento con navitoclax encapsulado en el nanosistema ha demostrado mejorar la eficacia antitumoral, así como reducir las metástasis asociadas a este tipo de cáncer y disminuir la toxicidad sistémica vinculada al fármaco senolítico. El modelo de ratón con el que se ha trabajado es altamente agresivo y recapitula todas las características del cáncer de mama triple negativo humano, con lo cual los resultados obtenidos son de particular relevancia en términos de translación a clínica. Considerando que el fin último de este proyecto de tesis es el desarrollo de estrategias para eliminar células senescentes, en base a la química combinatoria en el sexto Capítulo se describe el cribado de una quimioteca de hexapéptidos para el descubrimiento de nuevos compuestos senolíticos. Como resultado del cribado se han identificado dos péptidos que han demostrado tener actividad senolítica in vitro en la línea celular de melanoma humano SK-MEL-103. El trabajo con los dos compuestos sigue en marcha y se sigue investigando su efecto en otros modelos celulares así como su diana de acción, puesto que el desarrollo de estos dos hexapéptidos prometedores podría llegar a permitir en un futuro la eliminación de células senescentes, tanto en procesos de enfermedad ligada a envejecimiento como en pacientes sometidos a tratamientos de quimioterapia que inducen senescencia. Por último, en el séptimo Capítulo se resumen las conclusiones principales extraídas de los estudios con el conjunto de nanopartículas en los diferentes modelos tanto celulares como murinos, así como las conclusiones generales extraídas del desarrollo de esta tesis doctoral. En la actualidad y debido al envejecimiento poblacional, existe un gran interés económico por el desarrollo de nuevos fármacos que mejoren la calidad de vida en pacientes de edad avanzada o con patologías relacionadas con la edad, como es el cáncer. La conclusión principal de la tesis plantea que el desarrollo de nanomateriales mesoporosos de sílice para la liberación controlada de fármacos se presenta como una nueva estrategia con gran potencial en el campo de las enfermedades relacionadas con procesos de senescencia, y se espera que los resultados obtenidos sirvan de base para el diseño de nuevos nanomateriales inteligentes dirigidos tanto a la detección como al tratamiento de dichas enfermedades.

[EN] This PhD thesis, entitled “Design and developing of new therapeutic nanodevices for the treatment of diseases related to senescence processes”, is focused on the design, preparation, characterization and functional evaluation (both in vitro and in vivo, in different cellular and murine models) of a set of hybrid organicinorganic nanomaterials, based on mesoporous silica nanoparticles loaded with fluorescent or therapeutic molecules and functionalized with galacto-saccharides. These galacto-saccharides act as molecular gates, and control the encapsulated cargo release selectively in senescent cells. The first Chapter, corresponding to a general Introduction, includes an overview of the biologic scenario in which this thesis is based on: senescence. Also the different concepts related to nanomedicine, mesoporous materials, molecular gates and drug controlled released are presented, as well as the biologic nanoparticles interaction with cells and organism and their possible therapeutic application. Next, in the second Chapter, the general objectives of this PhD thesis and the specific objectives that will be addressed in the following experimental Chapters are presented. The third Chapter recapitulates the synthesis process and the nanoparticles structural and in vitro functional characterization for controlled released in senescent cells. In this section the design of the nanodevice is presented, and the different solids that will be studied in the following Chapters are described. These solids differentiate from each other in the encapsulated cargo, as some nanoparticles are loaded with different fluorophores (for detection) and others are loaded with different therapeutic drugs. In all cases the system is functionalized with galacto-hexa-saccharides acting as molecular gates. As well in this Chapter several standard characterization techniques are described, such as X ray diffraction, electronic transmission microscopy, etc. After the full characterization of the nanoparticles set, and once the correct behaviour of the molecular gate has been already validated in presence of the external stimuli of β-galactosidase, the next step consists of the study of the nanosystem in both cellular and murine models of different senescence-related diseases. Therefore, the fourth Chapter describes how nanoparticles loaded with the fluorophore rhodamine B are able to preferentially release their cargo in senescent cells, in cell cultures and also in in vivo mouse model. Then a cancer model is presented, in which the cytotoxic drug encapsulated in the nanoparticles – specifically, doxorubicin – gets the targeted tumoral cells in which previously senescence has been induced by palbociclib, and contributes to tumour regression. This cytotoxic nanoparticles validation is also described in a pulmonary fibrosis model, where nanoparticles get and selectively eliminate senescent cells that are accumulated as consequence of the disease, achieving a pulmonary function recovery. Moreover, in both models it is also demonstrated that the encapsulation can reduce doxorubicin secondary effects such as cardiotoxicity. In this Chapter not only a nanotherapy-based strategy that could be used as treatment to selectively eliminate senescent cells is presented, but also a versatile system that could be used for clinic image diagnosis by contrast agents’ encapsulation is described. Based on the obtained results in melanoma and pulmonary fibrosis models, the fifth Chapter presents the combination of senogenesis (senescence induction by palbociclib) and targeted nano-formulated senolysis in an orthotopic triple negative breast cancer model. Senescence-specific nanoparticles are loaded in this case with the senolytic drug navitoclax, which clinical used is not approved because of the systemic toxicity that causes in the organism. In this work it has been demonstrated that palbociclib is able to induce senescence in a triple negative breast cancer model also negative for the androgen receptor, a new subgroup that had not been previously described as sensitive to this drug. The combination of senescence induction and subsequent encapsulated navitoclax treatment shows an improved antitumoral efficacy, as well as a metastasis reduction and a diminished systemic toxicity related to the senolytic drug. The mouse model that has been used is highly aggressive and faithfully recapitulates all the human triple negative breast cancer characteristics, so the obtained results are of particular relevance in terms of clinical translation. Considering that the main aim of this thesis project is the development of new strategies for senescent cells elimination, and basing on combinatory chemistry, the sixth Chapter focuses on the screening of a hexapeptides library for new senolytic compounds discovery. The screening has led to the identification of two peptides with in vitro senolytic activity in the human melanoma cell line SK-MEL103. Studies with both compounds are still on-going, in order to investigate their effect in other cellular models and their molecular target. This two promising hexapeptides may allow the future elimination of senescent cells in age-related diseases, or in patients that have been treated with senescence-inducing chemotherapy. Finally, the principal conclusions from the studies with this set of nanoparticles in the different cellular and murine models, as well as the general conclusions from this PhD thesis, are presented in Chapter seven. Today, and because of population aging, there is a big economical interest in developing new drugs for aged patients or patients with age-related diseases, such as cancer. The main conclusion proposes that the development of mesoporous silica nanoparticles for controlled drug release applications can be a new high potential strategy in the field of senescence-related diseases, and it is expected that the obtained results could be the basis for the design of new smart nanomaterials targeting both detection and treatment of this diseases.

[CA] La present tesi doctoral, titulada “Desenvolupament de nous nanodispositius terapèutics aplicats al tractament de malalties relacionades amb processos de senescència”, es centra en el disseny, preparació, caracterització i avaluació funcional (tant in vitro com a in vivo en diferents models cel·lulars i murins) d’un conjunt de nanomaterials híbrids orgànic-inorgànics, basat en nanopartícules mesoporoses de sílice que porten per càrrega molècules fluorescents o terapèutiques i que estan funcionalitzades amb galacto-sacàrids. Estos galactosacàrids actuen com portes moleculars, i són els responsables de controlar la alliberació de les molècules encapsulades de manera selectiva en cèl·lules senescents. En el primer Capítol, corresponent a la Introducció, es presenta l’escenari biològic sobre el qual es basa aquesta tesi, la senescència. També es presenten els diferents conceptes relacionats amb la nanomedicina, els materials mesoporosos, les portes moleculars i la alliberació controlada de fàrmacs, així com la interacció de les nanopartícules amb les cèl·lules i l’organisme i la seua possible aplicació com a teràpia. A continuació, en el segon Capítol, s’exposen els objectius generals de la present tesi doctoral així com els objectius concrets que s’abordaran en els diferents Capítols experimentals. El tercer Capítol recull el procés de síntesis i de caracterització estructural i funcional in vitro de les nanopartícules per alliberació controlada en cèl·lules senescents. En este apartat es presenta el disseny del nanodispositiu i es descriuen els diferents sòlids amb els que es treballa en la resta de Capítols. La diferència entre ells radica en la càrrega encapsulada, ja que es preparen nanopartícules carregades amb diferents fluoròfors (per a fins de detecció) i nanopartícules carregades amb diferents fàrmacs (per a fins terapèutics). En tots els casos el sistema està funcionalitzat amb un galacto-hexa-sacàrid que actua com a porta molecular. Es descriuen a més les diferents tècniques de caracterització estàndard, com estudis de difracció de raigs X, microscòpia de transmissió electrònica, etc. Una vegada caracteritzats els diferents sòlids, i havent-se validat el correcte funcionament de la porta molecular en presència de l’estímul de β-galactosidasa, es procedeix a estudiar el comportament del sistema en models tant cel·lulars com murins de diferents malalties relacionades amb processos de senescència. Així dons, en el quart Capítol es descriu en primer lloc com el sistema carregat amb el fluoròfor rodamina B es capaç d’alliberar de manera preferencial la seua càrrega en cèl·lules senescents, tant en cultiu cel·lular com en model in vivo de ratolí. A continuació es presenta un model de càncer en el que el fàrmac citotòxic encapsulat en les nanopartícules – concretament la doxorrubicina – arriba a les cèl·lules tumorals diana en les que prèviament s’ha induït senescència amb palbociclib i contribueix a la regressió del tumor. També es descriu la validació d’estes nanopartícules citotòxiques en un model de fibrosis pulmonar, en el que es demostra que el sistema arriba i elimina selectivament les cèl·lules senescents que s’acumulen com a conseqüència de la malaltia, aconseguint així restaurar la funció pulmonar. En ambos models es demostra a més que la encapsulació aconsegueix reduir els efectes secundaris de la doxorrubicina, entre els que cap destacar la cardiotoxicitat. Per tant en aquest Capítol no sols es presenta una estratègia basada en nanoterapia que podria utilitzar-se com a tractament per a eliminar de manera selectiva cèl·lules senescents, sino que també es descriu un sistema versàtil que podria utilitzar-se per a diagnòstic per imatge clínica encapsulant traçadors o agents de contrast. En base als resultats obtinguts en els models de melanoma i de fibrosis pulmonar, en el quint Capítol es descriu la combinació de senogènesis (inducció de senescència amb palbociclib) i senolisis dirigida mitjançant nano-formulació en un model ortotòpic de càncer de mama triple negatiu. Les nanopartícules específiques per a cèl·lules senescents estan carregades en este cas amb el fàrmac senolític navitoclax, l’ús del qual en clínica actualment no està aprovat degut als efectes secundaris que provoca en l’organisme. En aquest treball s’ha vist que el fàrmac palbociclib es capaç d’induir senescència en un model de càncer de mama triple negatiu i negatiu per al receptor d’andrògens, un subgrup per al qual fins ara no s’havia descrit sensibilitat. La combinació de la inducció de senescència amb el posterior tractament amb navitoclax encapsulat en el nanosistema ha demostrat millorar la eficàcia antitumoral, així com reduir les metàstasis associades a aquest tipus de càncer i disminuir la toxicitat sistèmica vinculada al fàrmac senolític. El model de ratolí amb el que s’ha treballat és altament agressiu i recapitula totes les característiques del càncer de mama triple negatiu humà, per tant els resultats obtinguts són de particular rellevància en termes de translació a clínica. Considerant que el fi últim d’este projecte de tesi es el desenvolupament d’estratègies per a eliminar cèl·lules senescents, en base a la química combinatòria en el sext Capítol es descriu el garbellat d’una quimioteca d’hexapèptids per al descobriment de nous compostos senolítics. Com a resultat del garbellat s’han identificat dos pèptids que han demostrat tindre activitat senolítica in vitro en la línia cel·lular de melanoma humà SK-MEL-103. El treball amb els dos compostos segueix en marxa i es continua investigant el seu efecte en altres models cel·lulars així com la seua diana d’acció, ja que el desenvolupament d’estos dos hexapèptids prometedors podria arribar a permetre en un futur la eliminació de cèl·lules senescents, tant en processos de malaltia lligada a envelliment com en pacients sotmesos a tractaments de quimioteràpia que indueixen senescència. Per últim, en el Capítol set es resumeixen les conclusions principals que s’extrauen dels estudis amb el conjunt de nanopartícules en els diferents models tant cel·lulars com murins, així com les conclusions generals extretes del desenvolupament d’aquesta tesi doctoral. En l’actualitat i degut al envelliment poblacional, existeix un gran interès econòmic per el desenvolupament de nous fàrmacs que milloren la qualitat de vida en pacients d’edat avançada o amb patologies relacionades amb l’edat, com és el càncer. La conclusió principal de la tesi planteja que el desenvolupament de materials mesoporosos de sílice per a la alliberació controlada de fàrmacs es presenta com una nova estratègia amb gran potencial en el camp de les malalties relacionades amb processos de senescència, i s’espera que els resultats obtinguts servisquen de base per al disseny de nous nanomaterials intel·ligents dirigits tant a la detecció com al tractament de dites malalties.