Impact of perinatal factors on the maternal- neonatal microbiota and influence on health outcomes

Abstract

[EN] The importance of the microbiota for host health and disease is now widely appreciated. Microbial communities that inhabit the human body have been proposed as an essential aspect of the hypothesis focused on the developmental origin of health and disease (DOHaD), suggesting that altered microbial exposure during infancy could play a role in the risk of some immune-based diseases, such as obesity, allergy development or T2 diabetes mellitus. Indeed, associational studies have related perinatal factors that could disrupt neonatal microbial colonization, such as antibiotic intake, Csection and formula feeding, to these diseases later in life. Some authors have suggested that the interaction between the initial microbiome and the developing immune system could be crucial for a correct maturation of the latter. However, the exact molecular mechanisms that regulate the host−microbiome interconnection during this period are still unknown. Furthermore, despite the importance of maternal microbiota on initial neonatal microbial seeding, data concerning the effect of these perinatal factors on maternal microbiota are still scarce. Objectives: The general aim of the thesis was to to ascertain the impact of perinatal factors, such as mode and place of delivery, antibiotic use, maternal diet and gestational age on maternal-neonatal microbiota composition and their implications on health outcomes. Subjects: Participants in this study were part of a larger longitudinal cohort study conducted in the Mediterranean area, between 2015 and 2019. Mothers were enrolled in the Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Hospital Clinico Universitario de Valencia, primary health-care units from Valencia and CEIC-Parc de Salut MAR. In this thesis, faecal samples at birth, 7 and 31 days were used as well as the saliva, amniotic fluid and placenta samples from a subset of participants. Methods: Next-generation sequencing targeting the V3−V4 region of the 16S rRNA gene was performed to assess the microbiota composition at each time point. Enzymelinked immunosorbent assay and Luminex assay were used for the determination of the molecular hormonal, metabolic and immune status of the participants and/or cellular models. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription PCR were also performed in a quantitative measurement of microbiota composition and for the assessment of gene expression in placental tissue and cellular models, respectively. The culture of different cell lines, including intestinal epithelial cells (Caco-2), mucusproducer cells (LSTH-17) and monocyte-like cells (THP-1), were used for the in vitro assays. Results and conclusion: Maternal microbiota at delivery was influenced by several perinatal factors, including immune status of amniotic cavity, diet during gestation and delivery mode. Maternal consumption of fat was positively related to Firmicutes spp. while carbohydrates, fibre and polyunsaturated fatty acids (PUFA) intakes were associated with higher relative abundance of Bacteroidetes and Proteobacteria levels. Some of these relations were also reflected in the neonatal microbiota at delivery. Indeed, children born by C-section and from mothers with higher fat intakes showed higher body mass index (BMI) index z-scores than those born from mothers with higher fibre consumption. Two bacterial profiles were found during the study. The first one was composed of health-related bacteria with short-chain fatty acids (SCFA) production activity, such as Roseburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira or Bacteroides genera. This group was associated with a distinct amniotic cytokine profile characterized by higher concentrations of IL-2, IL-5, IL-17 and TNF-α. Indeed, salivary cortisol concentration also showed positive relations with some of these genera independently of the delivery mode. The other group was characterized by Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroaoccus, Porphyromonas and Campylobacter genera. Those were associated with another amniotic cytokine profile dominated by IL-4, IL-13, IL-18, and IL-10 cytokines and more highly represented in mothers who had undergone a Csection. Some of these genera were negatively associated with salivary cortisol concentration. Thus, our results suggested that amniotic fluid immune status and cortisol concentration were related to maternal microbiota at delivery with implications also in neonatal microbiota. Furthermore, we described the effect of mode and place of birth in the microbial colonization evolution during the first month of life, showing that neonates born by Csection had a distinct microbial pattern and higher BMI index z-scores than vaginalborn infants, both at home and hospital. We proposed an in vitro molecular mechanism by which the differences observed in C-section-born neonates in terms of microbiota composition would promote a shift in immune system maturation through the lack of immune stimulation observed in these samples compared with those from vaginal-born infants, especially those from the home birth group. Thus, disruptions in the colonization process during the first month of life could have long-lasting consequences through an alteration of immune system development during this period.

[ES] El gran impacto del microbioma humano sobre la salud del huésped es ampliamente conocido. Se cree que las comunidades microbianas que habitan el cuerpo humano serían un aspecto fundamental en la hipótesis promulgada sobre el posible origen de la enfermedad durante el desarrollo (DOHad) sugiriendo que alteraciones en la exposición microbiana durante la infancia podrían estar implicadas en el mayor riesgo de algunas enfermedades de base inmunológica como la obesidad, la alergia o la diabetes mellitus de tipo II. Además, se han encontrado relaciones significativas entre este tipo de enfermedades con algunos factores perinatales que se han descrito como disruptores del proceso de colonización, como la cesárea, el uso de antibióticos o la alimentación mediante leche de formula. Algunos autores sugieren que la interacción entre la microbiota inicial y el sistema inmunológico que está desarrollándose sería crucial para una correcta maduración de este. Sin embargo, los mecanismos exactos que mediarían en esta relación huésped-microbiota durante este periodo todavía se desconocen. Además, a pesar de la importancia de la microbiota materna para el inicio del proceso de colonización, todavía es escasa la información sobre como los diferentes factores perinatales afectan a la microbiota materna. Objetivos: El objetivo general de esta tesis fue definir el impacto de los diferentes factores perinatales como el tipo de parto, el uso de antibióticos, la dieta materna o la edad gestacional en la composición de la microbiota materno-neonatal y sus posibles implicaciones para la salud. Participantes: Los participantes del presente análisis son parte de un estudio longitudinal de cohorte desarrollado en el área mediterránea entre 2015 y 2019. Las madres fueron reclutadas en el Hospital Universitario y Politécnico de la Fe, el Hospital Clínico Universitario de Valencia, centros de atención primaria de la ciudad de Valencia y el CEIC-Parc de Salut MAR. En el presente trabajo se utilizaron las muestras fecales recogidas al parto, a los 7 y 31 días, así como las muestras de saliva, líquido amniótico y placenta de un grupo reducido de participantes. Métodos: Se utilizaron técnicas de secuenciación de nueva generación dirigidas a la región V3-V4 del gen 16S rRNA para la determinación de la composición de la microbiota de cada muestra a los tiempo estudiados. Además, el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas y la técnica Luminex fueron usadas para la determinación de moléculas relacionadas con el estado hormonal, metabólico e inmune de las muestras y/o de los ensayos celulares. La PCR cuantitativa y la de transcripción reversa fueron usadas para realizar una medida cuantitativa de la composición microbiana y de la expresión de algunos genes seleccionados en las muestras de placenta y modelos celulares, respectivamente. EL cultivo de diferentes líneas celulares, como líneas epiteliales (Caco-2), productoras de moco (LSTH-17) y líneas similares a macrófagos (THP-1) fueron utilizadas en los ensayos in vitro. Resultados y conclusión: La microbiota materna al parto estuvo influenciada por diversos factores perinatales, incluyendo el estado inmunológico de la cavidad amniótica, la dieta durante el embarazo y el tipo de parto. El consumo materno de grasa estuvo positivamente relacionado con Fimicutes spp. Mientras que el consumo de carbohidratos, fibra y ácidos grasos poliinsaturados fueron asociados con mayores abundancias relativas de los filos Bacteroidetes y Proteobacteria. Algunas de estas relaciones fueron observadas también en la microbiota neonatal. Además, los niños nacidos por cesárea y de madres con altos consumos de grasa mostraron mayores IMC (índice de masa corporal) z-scores que aquellos que nacieron de madres consumidoras de fibra. Dos patrones microbianos fueron encontrados a lo largo de todos los análisis. El primero de ellos estaba compuesto por especies asociadas a la salud y productoras de SCFA como los géneros Roseburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira o Bacteroides. Este grupo estuvo asociado a un perfil de citoquinas caracterizado por IL2, IL-5, IL-17 y TNF-α. Los niveles de cortisol en saliva estuvieron positivamente correlacionados con algunos de estos géneros independientemente del tipo de parto. El otro patrón microbiano estuvo caracterizado por los géneros Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroaoccus, Porphyromonas y Campylobacter. Estos estuvieron relacionados con un perfil de citoquinas en la cavidad amniótica dominados por la presencia de IL-4, IL-13, IL-18 y IL-10 y con el parto por cesárea. Además, algunos de estos géneros estuvieron negativamente correlacionados con los niveles de cortisol en saliva. Así, nuestros resultados sugieren que el ambiente inmunológico de la cavidad uterina y la concentración de cortisol estuvieron relacionados con la composición de la microbiota materna al parto con implicaciones para la microbiota neonatal. Además, describimos el efecto del tipo de parto y el lugar en el proceso de colonización durante el primer mes de vida mostrando que los niños nacidos por cesárea tienen un perfil diferencial de microbiota y mayores IMC z-scores que los niños nacidos de forma vaginal, tanto en el hospital como en casa. En nuestra investigación, hemos propuesto un mecanismo molecular por el cual las diferencias en la composición microbiana de los niños nacidos por cesárea podrían provocar una alteración en la maduración del sistema inmunológico mediante la falta de imnunoestimulación observada estas muestras comparadas con aquellas obtenidas de los niños nacidos por parto vaginal, especialmente de aquellos nacidos en casa. Así, las alteraciones en el proceso de colonización durante el primer mes de vida podrían tener consecuencias a largo plazo en la salud infantil debido a una alteración del desarrollo del sistema inmunológico durante este periodo.

[CA] El gran impacte del microbioma humà sobre la salut humana del hoste és amplament reconegut. Es creu que les comunitats microbianes que habiten el cos humà serien un aspecte fonamental en la hipòtesi promulgada sobre el possible origen de la malaltia durant el desenvolupament (coneguda com DOHad) suggerint que alteracions en l’exposició microbiana al llarg de la infància podrien estar implicades en el augment del risc a patir algunes malalties amb base immunològica com són l’obesitat, l’al·lèrgia o la diabetis mellitus tipus II. Així mateix, s’han trobat relacions significatives entre aquest tipus de malalties amb alguns factors perinatals que s’han descrit com disruptors del procés de colonització, com la cesària, l’ús d’antibiòtics o l’alimentació mitjançant llet de fórmula. Alguns autors suggereixen que la interacció entre la microbiota inicial i el sistema immunològic que estaria desenvolupant-se seria crucial per a una correcta maduració d’aquest últim. No obstant això, els mecanismes exactes que mediten en aquesta relació hoste-microbiota durant aquest període encara es desconeixen. A pesar de la importància de la microbiota materna en l’inici del procés de colonització, encara és escassa la informació sobre els diferents factors perinatals que afecten a la microbiota materna. Objectius: L’objectiu general d’aquesta tesi fou definir l’impacte dels diferents factors perinatals com el tipus de part, l’ús d’antibiòtics, la dieta materna o l’edat gestacional en la composició de la microbiota materno-neoantal i les possibles implicacions sobre la salut. Participants: Els participants del present anàlisi són part d’un estudi longitudinal de cohort de l’àrea mediterrània entre el 2015 i 2019. Les mares van ser reclutades en l’Hospital Universitari i Politècnic La Fe, l’Hospital Clínic Universitari de València, centres d’atenció primària de la ciutat de València i el CEIC-Pac de Salut Mar de Catalunya. En el present treball s’utilitzaren les mostres fecals recollides al part, als 7 i als 31 dies, així com les mostres de saliva, líquid amniòtic i placenta. Mètodes: S’utilitzaren tècniques de seqüenciació de nova generació dirigides a la regió V3-V4 del gen 16S rRNA per a la determinació de la composició de la microbiota de cada mostra als temps estudiats. Així mateix, l’assaig per immune adsorció lligat a enzims i la tècnica Luminex foren utilitzades per a la determinació de molècules relacionades amb l’estat hormonal, metabòlic e immunològic de les mostres i/o els assajos cel·lulars. La PCR quantitativa i la de transcripció en mode revers foren utilitzades per a realitzar una mesura quantitativa de la composició de la microbiota i de l’expressió d’alguns gens seleccionats en les mostres de placenta i models cel·lulars, respectivament. El cultiu de diferents tipus cel·lulars, com tipus epitelials (Caco-2), productors de moc (LSTH-17) i línies similars a macròfags (THP-1) foren utilitzades en els assajos in vitro. Resultats i conclusió: La microbiota materna en el moment del part va estar influenciada per diversos factors perinatals, incloent l’estat immunològic de la cavitat amniòtica, la dieta durant l’embaràs i el tipus de part. El consum matern de greix es va vore associat amb Fimicutes spp. Pel contrari, el consum de carbohidrats, fibra i àcids grassos poliinsaturades es van veure relacionats amb majors abundàncies relatives dels phylum Bacteroidetes i Proteobacteria. Algunes d’aquestes relacions foren també observades en la microbiota neonatal. Tan mateix, els nounats nascuts per cesària i de mares consumidores de greixos van mostrar majors índexs de massa corporal (IMC) zscores que els nonats nascuts de mares consumidores de fibra. Dos patrons microbians es trobaren al llarg de totes les anàlisis. La primera d’elles va estar composta per espècies associades amb la salut i productes d’àcids grassos de cadena curta (SCFA), com són els gèneres Rosburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira o Bacteroides. Aquest grup va estar associat a un perfil de citocines caracteritzat per interleucines (IL)-2, IL-5, IL-17 i TNF-alpha. Els nivells de cortisol en saliva al part estigueren positivament correlacionats amb alguns d’aquests grups , independentment del tipus de part. L’altre patró microbià estava caracteritzat per els gèneres Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroccocus, Porphyromonas i Campylobacter. Aquests grups foren relacionats amb el part per cesària i un perfil de citoquines en la cavitat amniòtica dominat per la presència de IL-4, IL-13, IL.18 i IL-10. A més, alguns d’aquests gèneres estigueren negativament relacionats amb els nivells de cortisol en saliva en el moment del part. Així, els nostres resultats suggereixen que l’ambient immunològic de la cavitat uterina i la concentració de cortisol tenien una relació amb la composició de la microbiota materna al part amb implicacions per a la microbiota neonatal. Tan mateix, descrivim l’efecte del tipus de part i el lloc de naixement (hospital vs. casa) en el procés de colonització durant el primer mes de vida, mostrant que els nonats nascuts per cesària tenien un perfil diferencial de microbiota i majors índexs de massa corporal (IMC) z-scores que aquells nonats nascuts de forma vaginal, tant a l’hospital com a casa. En la nostra investigació, hem proposat un mecanisme molecular pel qual les diferències en la composició microbiana podrien provocar una alteració en la maduració del sistema immunològic mitjançant una manca de inmuno-estimulació, observada en les mostres obtingudes dels nounats nascuts per cesària, especialment si es compara amb aquells nascuts a casa. Així, les alteracions en el procés de colonització, durant el primer mes de vida podrien tenir conseqüències a llarg termini en la salut infant debut a alteracions en el desenvolupament del sistema immunològic durant el període.