A dynamic snapshot of bud dormancy in peach

Abstract

[EN] The general aim of this thesis is to study the dormancy process from a molecular point of view identifying mechanisms and targeting genes that control it. In order to do that we have focused on the study of three genes that are differentially expressed during reproductive bud development within the conceptual framework of the three major processes that converge spatially and temporally in a reproductive bud: dormancy, stress tolerance and flower development. The first gene is down-regulated in dormancy release flower buds and encodes a STRESS ASSOCIATED PROTEIN (PpSAP1) that contains Zn-finger domains A20 and AN1. SAP proteins have been related to stress tolerance response in both plants and animals and in fact, we have shown that drought stress induces its expression in buds, resembling other SAP genes in plants. Moreover, the constitutive expression of PpSAP1 in plum increases its tolerance to water stress by increasing water retention. Likewise, transgenic plum plants show leaf alterations related to reduced cell size concomitant with the down-regulation of genes involved in cell growth. All these studies suggest a dual role of PpSAP1 in stress tolerance response and cell growth during peach dormancy. The second gene is PpeS6PDH, coding for an enzyme with sorbitol-6-phosphate dehydrogenase activity. PpeS6PDH is differentially regulated during bud development, highly expressed in dormant buds consistently with sorbitol accumulation. Concomitantly with PpeS6PDH down-regulation in dormancy-released flower buds, chromatin around the translation start site of the gene shows changes in the methylation state of specific residues of histone H3 (H3K4 and H3K27). These data suggest the transcriptional regulation of PpeS6PDH expression by chromatin modification mechanisms. Moreover, abiotic stresses affect PpeS6PDH expression. Low temperature treatments induce gene expression in buds and leaves, whereas desiccation up-regulates PpeS6PDH in buds and represses the gene in leaves. These data suggest the participation of PpeS6PDH in tolerance against cold and water deficit stresses in buds. Finally, the third gene is PpeDAM6, one of the major regulators of bud dormancy in peach. PpeDAM6 is sharply down-regulated during bud development concomitantly with dormancy release events. This repression is in part due to the direct binding of PpeBPC1, a BASIC PENTACYSTEINE PROTEIN, to the GAGA motifs present in an intronic regulatory region of PpeDAM6 gene that becomes enriched in H3K27me3 chromatin modification after dormancy release. In addition, the ectopic expression of PpeDAM6 in Arabidopsis shows abnormal flower phenotypes resembling 35S::SVP plants. On the other hand, overexpression in plum causes stunted growth in the transgenic lines due to an altered hormonal homeostasis. The changes in hormone content are mediated by the modulation of genes involved in jasmonic acid, cytokinins and gibberellic acid metabolism and signalling pathways. These results suggest that PpeDAM6 works as a master growth repressor maintaining dormancy, stress tolerance response and flowering inhibition by mainly modulating hormone homeostasis. Therefore, this thesis provides a dynamic snapshot of different molecular mechanism that take place inside the bud. The studied genes have a crucial role regulating dormancy processes, stress tolerance response and flowering pathways and all of them are potential candidate genes for breeding new plants more adapted to the climate change.

[ES] El objetivo general de esta tesis es el estudio de la latencia desde un punto de vista molecular, identificando mecanismos y genes diana que la controlen. Para ello, nos hemos centrado en el estudio de tres genes que se expresan de manera diferencial durante el desarrollo de una yema reproductiva en melocotón, bajo el marco conceptual de los tres procesos que convergen espacialmente y temporalmente en una yema reproductiva: latencia, tolerancia a estrés y desarrollo floral. El primer gen que se estudió codificó para una STRESS ASSOCIATED PROTEIN (PpSAP1) con dos dominios tipo Zn-finger, A20 y AN1 que disminuye su expresión durante la latencia. Las proteínas tipo SAP se han relacionado con resistencias a distintos tipos de estrés tanto en plantas como en animales. De hecho, se ha visto que PpSAP1 aumentó su expresión en yemas de melocotón bajo condiciones de estrés por sequía, de forma similar a como lo hacen otras SAP en distintas plantas. Además, la expresión ectópica de PpSAP1 en ciruelos transgénicos ha permitido aumentar la tolerancia a estrés hídrico en estas líneas al incrementar la cantidad de agua retenida. Asimismo, estas plantas transgénicas también mostraron alteraciones en el tamaño de las hojas, provocadas principalmente por una menor área celular de las células que formaban parte de ellas y relacionadas con una represión de distintos genes implicados en crecimiento celular. Todo ello sugiere que PpSAP1 probablemente tenga una doble función relacionada tanto con resistencia a estrés como con crecimiento celular durante la latencia de melocotonero. El segundo gen de estudio fue PpeS6PDH, el cual codifica para una enzima con actividad sorbitol-6-fosfato deshidrogenasa. PpeS6PDH está diferencialmente regulado durante el desarrollo de la yema, aumentando su expresión en yemas latentes de manera consistente a la acumulación de sorbitol. Simultáneamente a la disminución de PpeS6pDH en las yemas no latentes, alrededor del sitio de inicio de la traducción del gen se mostraron cambios a nivel de cromatina en el estado de metilación de los residuos específicos de la histona H3 (H3K4 y H3K27). Estos datos apuntan a la existencia de una regulación transcripcional de PpeS6PDH a nivel de modificaciones de la cromatina. Además, también se ha visto que distintos tipos de estrés abiótico afectan a la expresión de PpeS6PDH. Tratamientos con bajas temperaturas inducieron su expresión tanto en yemas como en hojas, mientras que la desecación aumentó la expresión en yemas pero no en hojas. Estos estudios sugieren que la función de PpeS6PDH durante la latencia de melocotonero es dar tolerancia a estrés por frío y sequía. Finalmente, el tercer gen de estudio fue PpeDAM6, uno de los mayores reguladores de la latencia en yemas de melocotonero. PpeDAM6 está fuertemente reprimido durante el desarrollo de la yema con una relación directa con los eventos de salida de latencia. Esta represión se debe en parte a la unión directa de PpeBPC1, una BASIC PENTACYSTEINE PROTEIN, a dos motivos GAGA presentes en la región intrónica reguladora de PpeDAM6. Justamente esta región se encuentra modificada a nivel de cromatina con un enriquecimiento en H3K27me3 después de la salida de latencia. Además, la expresión ectópica de PpeDAM6 en Arabidopsis mostró fenotipos de floración anormal parecidos a los producidos en plantas 35S::SVP. Por otro lado, la sobreexpresión en ciruelos provocó retrasos en el crecimiento de las líneas transgénicas, debido a una alteración en los niveles hormonales. Así mismo, se determinó que estos cambios en la homeostasis hormonal estaban producidos por la regulación diferencial de genes involucrados en las rutas del ácido jasmónico, las citoquininas y del ácido giberélico en las plantas transgénicas. Estos resultados sugieren que PpeDAM6 actúa como un represor máster del crecimiento, manteniendo la latencia, la respuesta de tolerancia a estrés y la inhibición floral a través de la regulación del equilibrio hormonal. Con todo ello, esta tesis proporciona una instantánea dinámica de los diferentes mecanismos moleculares que tienen lugar dentro de la yema. Los genes estudiados tienen una función crucial regulando tanto el proceso de latencia como la respuesta de tolerancia a estrés y las rutas de floración, y todos ellos son potenciales candidatos para mejorar nuevas plantas más adaptadas al cambio climático.

[CA] L'objectiu general d'aquesta tesi és l'estudi de la latència des d'un punt de vista molecular, identificant mecanismes i gens diana que la controlen. Per això, ens hem centrat en l'estudi de tres gens que s'expressen d'una manera diferencial durant el desenvolupament d'una gemma reproductiva en el préssec, sota el marc conceptual dels tres processos que convergeixen espacialment i temporalment en una gemma reproductiva: latència, tolerància a estrés i desenvolupament floral. El primer gen d'estudi codifica per a una STRESS ASSOCIATED PROTEIN (PpSAP1) amb dos dominis tipus Zn-finger, A20 i AN1, i disminueix la seua expressió durant la latència. Les proteïnes tipus SAP s'han relacionat amb resistències a diferents tipus d'estrés tant en plantes com en animals. De fet, s'ha vist que PpSAP1 va augmentar la seua expressió en gemmes de préssec sota condiciones d'estrés per sequia, de manera similar a com ho fan altres SAPs en diferents plantes. A més, l'expressió ectòpica de PpSAP1 en pruneres transgèniques ha permés augmentar la tolerància a estrés en aquestes línies en incrementar la quantitat d'aigua retinguda. Així mateix, aquestes plantes trnasgèniques també mostraren alteracions en la mida de les fulles, causades principalmente per una menor àrea cel¿lular de les cèl¿lules que formen part d'elles i relacionades amb una repressió de diferents gens implicats en el creixement cel¿lular. Tot aço, suggereix que PpSAP1 probablement tinga una doble funció relacionada tant amb resistència a estrés com amb creixement cel¿lular durant la latència del préssec. El segon gen d'estudi va ser una PpeS6PDH, la qual codificava per a un enzim amb activitat sorbitol-6-fosfato dehidrogenasa. PpeS6PDH està diferencialment regulada durant el desenvolupament de la gemma, augmentant la seua expressió en gemmes latents de manera consistent a l'acumulació de sorbitol. Simultàniament a la disminució de PpeS6PDH en les gemmes no latents, al voltant del lloc d'iniciació de la traducció del gen es van mostrar canvis a nivell de cromatina en l'estat de metilació dels residus específics de la històna H3 (H3K4 i H3K27). Aquestes dades assenyalen l'existència d'una regulació transcripcional de PpeS6PDH a nivell de modificacions de la cromatina. A més, també s'ha vist que diferents tipus d'estrés abiòtic afecten a l'expressió de PpeS6PDH. Tractaments amb baixes temperatures van induir la seua expressió tant en gemmes com en fulles, mentres que la desecació va augmentar l'expressió en gemmes però no en fulles. Aquests estudis suggereixen que la funció de PpeS6PDH durant la latència del préssec és donar tolerància a estrés per fred i sequia. Finalment, el tercer gen d'estudi va ser PpeDAM6, un dels majors reguladors de la latència en gemmes de préssec. PpeDAM6 està fortament représ durant el desenvolupament de la gemma amb una relació directa amb els events d'eixida de la latència. Aquesta repressió és deguda en part a la unió directa de PpeBPC1, una BASIC PENTACUSTEINE PROTEIN, a dos motius GAGA presents en la regió intrònica reguladora de PpeDAM6. Justament aquesta regió es troba modificada a nivell de cromatina amb un enriquiment en H3K27me3 després de l'eixida de latència. A més, l'expressió ectòpica de PpeDAM6 en Arabidopsis va mostrar fenotips de floració anormal semblants als produïts en plantes 35S::SVP. Per un altra banda, la sobreexpressió en pruneres va provocar retards en el creixement de les línies transgèniques a causa d'una alteració en els nivells hormonals. Aixi mateix, es va determinar que aquests canvis en l'homeostasi hormonal estaven produïts per la regulació diferencial de gens involucrats en les rutes d'àcid jasmònic, citoquinines i àcid gibberèl·lic en les plantes transgèniques. Aquests resultats suggereixen que PpeDAM6 actua com un repressor master del creixement, mantenint la latència, la resposta de tolerància a estrés i la inhibició floral a través de la regulació de l’equilibri hormonal. Com a conclusió, aquesta tesi proporciona una instantània dinàmica dels diferents mecanismes moleculars que tenen lloc dins de la gemma. Els gens estudiats tenen una funció fonamental, regulant tant el mateix procés de la latència com la resposta de tolerància a estrés i les rutes de floració i tots ells són potencials candidats per a millorar noves plantes més adaptades al canvi climàtic.