Silenciamiento de genes de Nicotiana benthamiana mediante la expresión de precursores de pequeños ARNs artificiales incluidos en un ARN viroidal

Abstract

[ES] El silenciamiento génico mediado por RNA o interferencia por RNA (RNAi) es un conjunto de mecanismos de regulación de la expresión génica presente en la mayoría de grandes grupos taxonómicos, entre ellos las plantas, que tienen como elementos clave moléculas pequeñas de RNA (sRNA) de secuencia altamente complementaria a la de los genes silenciados. En plantas, el mecanismo cumple funciones tan diversas como el mantenimiento de la estabilidad del genoma, la regulación del desarrollo, la adaptación al medio o la defensa frente a patógenos, y puede desencadenarse tanto a partir de la expresión de genes endógenos, como los de los microRNAs (miRNAs), o de RNAs exógenos, como los genomas o transcritos de virus invasores. La sencillez del mecanismo que dota de especificidad al RNAi, simple complementariedad de bases de los sRNAs, ha propiciado la aparición de un gran número de desarrollos biotecnológicos que van desde plantas resistentes a determinados patógenos hasta plantas en las que la expresión de algunos de sus genes endógenos ha sido alterada. En este trabajo de fin de máster contribuiremos al desarrollo de estrategias para aprovechar las potencialidades biotecnológicas del RNAi en plantas. Para ello investigaremos las posibilidades de administrar RNAs bicatenarios (dsRNAs), que inducen con mucha eficiencia RNAi, así como precursores de miRNAs artificiales (amiRNAs) y sRNAs interferentes transactivos (tasiRNAs) sintéticos (syn-tasiRNAs) a los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Se diseñarán construcciones genéticas para expresar dsRNAs y precursores de amiRNAs y syn-tasiRNAs contra los genes reporteros CLA1 y Sulphur de Nicotiana benthamiana. El silenciamiento de ambos genes produce un fenotipo de blanqueamiento fácil de monitorizar. Una vez realizadas las construcciones genéticas, los RNAs a ensayar se producirán en reacciones de trascripción in vitro y mediante un novedoso sistema biofactoría, propio del grupo, en cultivos de Escherichia coli. La aplicación de RNAs exógenos en agricultura puede ser una alternativa a los fitosanitarios y fitoreguladores de síntesis química más específica, sostenible y respetuosa con el medio ambiente.

[EN] [EN] RNA-mediated gene silencing or RNA interference (RNAi) is a set of mechanisms of regulation of gene expression present in most large taxonomic groups, including plants, which have as key elements small RNA molecules (sRNA) of a sequence highly complementary to that of the transcripts of silenced genes. On-demand gene silencing can be induced by expressing artificial sRNAs such as artificial microRNAs (amiRNAs) or double stranded RNAs (dsRNAs) of sequence homologous to the gene to be silenced. Usually both amiRNAs and dsRNAs are produced in transgenic plants, which makes their commercial application difficult for crop improvement. This is why it is crucial to develop production methods and alternative applications, such as the large-scale RNA production system recombinants in Escherichia coli that we have recently developed, which requires that the RNA of interest is included in the ELVd sequence. In this master's degree tesis we have studied the silencing capacity of amiRNA precursors and dsRNAs included in the ELVd sequence. First of all, we have generated various constructs to silence the CLA1 and sulfur reporter genes of Nicotiana benthamiana, whose silencing affects chlorophyll synthesis and produces a yellowing of the tissue. These constructions were evaluated in expression tests transitory in N. benthamiana in which it was found that both the precursors of amiRNAs such as dsRNAs, both included in dELV RNA, induced the efficient silencing of the two reporter genes. Therefore, our results indicate that the ELVd sequence does not impede the silencing ability of these Interfering RNAs. In future work we intend to use our system of production in E. coli based on ELVd to produce large quantities of these amiRNAs and dsRNAs precursors and check whether their exogenous application in N. benthamiana induces the desired silencing.