Caracterización molecular de un nuevo tobamovirus que afecta a plantas de pimiento (Capsicum spp.). Análisis funcional y localización celular de la proteína de movimiento

Abstract

[ES] El pimiento (Capsicum spp.) es uno de los principales cultivos hortícolas en todo el mundo, llegando a producirse hasta 38 millones de toneladas. Algunas de las principales amenazas para la producción de pimientos son las plagas y enfermedades que comprometen el rendimiento y la calidad de estos productos. Las enfermedades causadas por virus son el principal factor limitante en el cultivo del pimiento en todo el mundo, afectando al crecimiento y fructificación de la planta. Se han descrito al menos cuarenta y nueve especies de virus capaces de infectar a Capsicum annum, de las cuales una veintena puede llegar a dañar este cultivo. Los virus más prevalentes son los de transmisión mecánica y por semilla, como los pertenecientes al género Tobamovirus, y los transmitidos por insectos como los pertenecientes a los géneros Potyvirus, Cucumovirus, Ortofotovirus y Begomovirus, entre otros. El punto de partida de este Trabajo Fin de Máster fue la observación de plantas de pimiento, procedentes de Granada y Vizcaya, con síntomas de mosaico verde claro y amarillo, abullonado en hoja joven y bandeado verde claro en los frutos, compatibles con una putativa infección por tobamovirus. Varios análisis serológicos y moleculares descartaron los principales virus que afectan al cultivo de pimiento, sugiriendo la presencia de un nuevo tobamovirus. El objetivo principal del presente proyecto consistió pues en la caracterización de la secuencia nucleotídica completa del putativo nuevo tobamovirus, identificando los marcos de lectura abiertos que codifican para el complejo de la replicasa (RdRp), la proteína de movimiento (MP) y la proteína de cubierta (CP), incluyendo la posibilidad de generar un clon infectivo. Las MPs son necesarias para el movimiento del virus a las células vecinas a través de los plasmodesmos (transporte célula a célula) y a la parte distal de la planta a través del tejido vascular (transporte a larga distancia). Las MPs de tobamovirus han sido asignados a la familia 30K, grupo donde pertenecen 18 géneros virales cuyas MPs están relacionadas con la MP de 30 kDa del virus del mosaico del tabaco y que comparten ciertas características comunes tales como interaccionar con los plasmodesmos y componentes del citoesqueleto de las células infectadas, así como la posibilidad de intercambiarse funcionalmente por la proteína correspondiente del sistema modelo del virus del mosaico de la alfalfa (AMV). Con la premisa de que el virus aislado de las plantas de pimiento sea un tobamovirus y su MP pertenezca a la superfamilia 30K, dos de los objetivos del presente proyecto fueron el análisis de la localización subcelular de la hipotética MP del nuevo tobamovirus mediante ensayos de expresión transitoria en plantas Nicotiana benthamiana, así como el análisis funcional de la MP mediante el sistema modelo del AMV. Finalmente se ha puesto a punto un sistema de detección viral específico basado en la hibridación molecular no radiactiva que permite determinar la incidencia del nuevo virus en cultivos de pimiento.

[EN] Hot and sweet peppers (Capsicum spp.) are important vegetable crops worldwide, currently with a production of thirty-eight million tonnes. Some of the main threats to pepper production are pests and diseases that compromise the yield and quality of cultivated vegetables. Diseases caused by virus are the main limiting factor in pepper cultivation in the world, affecting plant growth and fructification. At least forty-nine species of virus capable of infecting Capsicum annum have been described, among them twenty can cause damage to these crops. The most prevalent viruses are mechanically and seed-transmitted such as those belonging to the Tobamovirus genus, and insect-transmitted viruses assigned to Potyviruses, Cucumoviruses, Orthophotospoviruses, and Begomoviruses genera, among others. The starting point of the present Master`s Thesis was the presence of pepper plants form Granada and Vizcaya, showing light green and yellow mosaic symptoms compatible with a putative tobamovirus infection. Some serological and molecular analysis against the main viruses affecting pepper crops were negative, suggesting the presence of a new tobamovirus. One of the main objectives of the present project will be either the characterization of the complete nucleotide sequence of the putative new tobamovirus, identifying the three open reading frames encoding for the replicase complex (RdRp), the movement protein (MP) and the coat protein (CP), but also the possibility to generate an infectious clone. The MPs are required for translocation of the virus to the neighbor cells through the plasmodesmata structures (cellto-cell transport) and to the distal part of the plant via the vascular tissue (long distance transport). The tobamovirus MPs have been assigned to the 30K superfamily, a group of 18 viral genera which MPs are related to the 30 kDa MP of Tobacco mosaic virus. This protein group shares some key features, one is their capacity to interact with plasmodesmata and cytoskeleton components of infected cells meanwhile, another one is the observation that MPs of the 30K family are functionally exchangeable for the corresponding protein of Alfalfa mosaic virus(AMV) model system. With the premise that the virus isolated from pepper plants is a tobamovirus and its MP belongs to the 30K superfamily, two of the objectives of the present project will be the subcellular localization analysis of the hypothetical MP of the new tobamovirus by transient expression in Nicotiana benthamiana plants, and also the functional analysis of the MP by using the AMV system. Finally, a specific viral detection method based on non-radioactive molecular hybridization has been performed to determine the incidence of the new tobamovirusin pepper crops.