Process development for the obtention and use of recombinant glycosidases: expression, modelling and immobilisation

Abstract

El objetivo general de la presente tesis doctoral es el desarrollo de herramientas para la obtencion, produccion y aplicacion de dos enzimas glicosidicas: �¿-L-arabinofuranosidasa proveniente del hongo Aspergillus niger (Abf) y �À-D-glucosidasa (Bgl), proveniente de la levadura Candida molischiana. Estas hidrolasas se emplean en la liberacion de azucares en procesos de conversion de biomasa y en la industria alimentaria, pero tambien en la sintesis de aminoglicosidos, glicoconjugados y oligosacaridos, compuestos de alto valor anadido para la industria quimico-farmaceutica. Las enzimas se han expresado en la levadura metilotrofica Pichia pastoris, y se han purificado para caracterizar sus propiedades bioquimicas. Asimismo, se ha comprobado su capacidad para catalizar reacciones de transglicosilacion con alto rendimiento. En relacion a su produccion, se ha establecido y validado un modelo basado en restricciones del metabolismo de Pichia pastoris, evaluando su consistencia mediante analisis de flujos metabolicos posibilistico. El modelo permite estimar la tasa de crecimiento y la distribucion de flujos intracelulares a partir de unos pocos flujos extracelulares medidos experimentalmente. Adicionalmente, el modelo se ha extendido para estimar la productividad de proteina recombinante, y se ha empleado para analizar diferentes condiciones de cultivo de las cepas transgenicas que sobreproducen las enzimas Abf y Bgl. Finalmente, las enzimas se han inmobilizado en organosilicas bimodales de la familia UVM-7. Los biocatalizadores resultantes se han caracterizado bioquimica y fisico-quimicamente y se han evaluado en diferentes aplicaciones de interes biotecnologico.