Resistencia cruzada de Brassica spp. contra los patógenos vasculares, Fusarium oxysporum f.sp. conglutians, Verticillium longisporum y Xanthomonas campestris pv. campestris

Abstract

[EN] Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans (FOC) is an important soil-borne fungus that causes vascular wilt disease in Brassica crops, resulting in severe losses in both yield and quality. However, crop rotation and fungicide application are not effective to manage this disease due to the difficulty of eradicating this pathogen from the soil. Therefore, breeding of resistant cultivar is essential for the disease control. So far, a Japanese cabbage cultivar (cv.) Anju (Brassica oleracea), which contains an Anju-allele that localized in a single dominant resistant gene FOC-Bo1, has showed an enhanced resistance to FOC, while resistance in oilseed rape (B. napus, OSR) is still not available. Since OSR is a natural interspecific hybrid between B. oleracea and B. rapa, different turnip rape forms were crossed to the cabbage cv. Anju to generate the resynthesized OSR. The parental lines and the resynthesized lines were used in present study. Due to the similarity in colonization, other two vascular pathogens Verticillium longisporum (VL) and Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) was used to assess the cross-resistance of tested plant materials. To improve the assessment systems, several inoculation methods and a molecular detection system were evaluated, as well. To setup the evaluation methods, greenhouse experiments were conducted, in which 4 isolates of 3 pathogens were tested on two reference OSR plants with contrasting resistance responses. For FOC treatment, root dipping with conidia suspensions and soil inoculation with chlamydospores were applied. Although no significant variations in disease severity (DS) and stable correlations among different inoculation methods and spore concentrations were found in FOC treated trials, root dipping with 105 cfu/ml conidia suspension showed an obvious contrasting symptom in reference plants. Compared to soil inoculation with microsclerotia of VL, plants inoculated by root dipping with 106 cfu/ml conidia suspension displayed a faster development of disease symptom, which was as fast as the disease development in plants inoculated with 105 cfu/ml conidia suspension of FOC. Plants inoculated by root dipping with 108 cfu/ml of XCC showed clear disease symptom and have similar disease development rate as FOC and VL, while lower concentration and other inoculation methods (Cotyledon inoculation and foliar spraying of bacterial suspension) were not successful. The selected inoculation methods were applied to analyze the susceptibility of the parental lines and the resynthesized lines toward FOC, VL and XCC. The increased disease severity and reduction of stunting effects indicated the resynthesized OSR derived from crossing with Anju cultivar has an enhanced resistance to FOC. Besides, a significant reduction of susceptibility to XCC was found in RS line indicating that Anju-allele has a cross effect increasing the XCC resistance. However, no effect of Anju-allele was found on resistance against VL. In order to verify the visual observation, a molecular detection system for evaluating resistance of OSR was also established. Sixteen pairs of primers for FOC, VL andXCC detection derived from literature or own design were evaluated using real-time PCR. Primers with high sensitivity and specificity were selected to quantify fungal DNA. In conclusion, a visual assessment system and a molecular detection system were established in present study for investigation of cross resistance of Brassica plant toward vascular pathogens (FOC, VL and XCC). Resynthesized OSR with Anju-allele had enhanced resistance toward FOC and XCC but not VL.

[ES] Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans (FOC) es un hongo importante del suelo que causa la enfermedad del marchitamiento vascular en los cultivos de Brassica spp., lo que resulta en graves pérdidas tanto en rendimiento como en calidad. Sin embargo, la rotación de cultivos y la aplicación de fungicidas no son efectivas para manejar esta enfermedad debido a la dificultad de erradicar este patógeno del suelo. Por lo tanto, la reproducción de cultivares resistentes es esencial para el control de enfermedades. Hasta ahora, una variedad de col japonesa (cv.) Anju (Brassica oleracea), que contiene un alelo Anju que se localiza en un solo gen resistente dominante FOC-Bo1, ha mostrado una resistencia mejorada a FOC, mientras que la resistencia en colza (B .napus, OSR) todavía no está disponible. Dado que OSR es un híbrido interespecífico natural entre B. oleracea y B. rapa, se cruzaron diferentes formas de colza con el cv. de repollo Anju, para generar el OSR resintetizado. Las líneas parentales y las líneas resintetizadas se utilizaron en el presente estudio. Debido a la similitud en la colonización, otros dos patógenos vasculares Verticillium longisporum (VL) y Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) se utilizaron para evaluar la resistencia cruzada de los materiales vegetales probados. Para mejorar los sistemas de evaluación, también se evaluaron varios métodos de inoculación y un sistema de detección molecular. Para configurar los métodos de evaluación, se llevaron a cabo experimentos de invernadero, en los que se probaron 4 aislados de 3 patógenos en dos plantas OSR de referencia con respuestas de resistencia contrastantes. Para el tratamiento con FOC, se aplicó inmersión de raíces con suspensiones de conidios e inoculación del suelo con clamidosporas. Aunque no se encontraron variaciones significativas en la gravedad de la enfermedad (DS) y correlaciones estables entre los diferentes métodos de inoculación y concentraciones de esporas en los ensayos tratados con FOC, la inmersión de raíces con 105 ufc / ml de suspensión de conidios mostró un síntoma contrastante obvio en las plantas de referencia. En comparación con la inoculación del suelo con microesclerocios de VL, las plantas inoculadas por inmersión de raíces con 106 ufc / ml de suspensión de conidios mostraron un desarrollo más rápido de los síntomas de la enfermedad, que fue tan rápido como el desarrollo de la enfermedad en plantas inoculadas con 105 ufc / ml de suspensión de conidios de FOC. Las plantas inoculadas por inmersión de raíces con 108 ufc / ml de XCC mostraron un síntoma claro de la enfermedad y tienen una tasa de desarrollo de la enfermedad similar a la de FOC y VL, mientras que la concentración más baja y otros métodos de inoculación (inoculación con cotiledones y pulverización foliar de suspensión bacteriana) no tuvieron éxito. Los métodos de inoculación seleccionados se aplicaron para analizar la susceptibilidad de las líneas parentales y las líneas resintetizadas hacia FOC, VL y XCC. El aumento de la gravedad de la enfermedad y la reducción de los efectos del retraso en el crecimiento indicaron que el OSR resintetizado derivado del cruce con la variedad Anju tiene una mayor resistencia a la FOC. Además, se encontró una reducción significativa de la susceptibilidad a XCC en la línea RS, lo que indica que el alelo Anju tiene un efecto cruzado que aumenta la resistencia a XCC. Sin embargo, no se encontró ningún efecto del alelo Anju sobre la resistencia contra VL. Para verificar la observación visual, también se estableció un sistema de detección molecular para evaluar la resistencia de OSR. Se evaluaron dieciséis pares de cebadores para la detección de FOC, VL y XCC derivados de la literatura o del propio diseño mediante PCR en tiempo real. Se seleccionaron cebadores con alta sensibilidad y especificidad para cuantificar el ADN fúngico.