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Efecto de las condiciones de cultivo en los programas de apoptosis intrínseco y extrínseco.

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Efecto de las condiciones de cultivo en los programas de apoptosis intrínseco y extrínseco.

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dc.contributor.advisor Galindo Orozco, Máximo Ibo es_ES
dc.contributor.advisor Iborra Rodríguez, Francisco José es_ES
dc.contributor.author Martín Sabuco, Álvaro es_ES
dc.date.accessioned 2021-07-08T10:30:22Z
dc.date.available 2021-07-08T10:30:22Z
dc.date.created 2021-06-16 es_ES
dc.date.issued 2021-07-08 es_ES
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10251/169001
dc.description.abstract [ES] La investigación en el descubrimiento y mejora de nuevas terapias anticancerígenas ha sido y es uno de los ámbitos más importantes en la investigación biomédica. Dentro de la gama de tratamientos actuales uno de los aspectos que más interesa mejorar es la reducción en los efectos adversos que pueden generar en el paciente, especialmente en los tratamientos más comúnmente usados como son la radioterapia y la quimioterapia. Los avances en el ámbito de la medicina personalizada buscan asignar a cada paciente el tratamiento que le sea más efectivo y a su vez que le haga padecer menor número de efectos adversos. Uno de los factores que influyen en la eficacia de los tratamientos anticancerígenos es el propio microambiente tumoral, microambientes más hipóxicos o más dependientes de determinado aminoácido puede provocar un aumento o disminución en la eficacia de los tratamientos. La propuesta de TFM ronda alrededor de dicho concepto y se busca realizar los primeros pasos hacia la clasificación de pacientes en función de su microambiente tumoral y así poder asignar el tratamiento adecuado. Para ello cultivamos células HeLa en tres medios distintos, en medio completo que actuarán como control, en medio suplementado con glucosa, y en medio sin glucosa suplementado con glutamina. A su vez, todos estos medios se cultivan tanto en normoxia como en hipoxia. Todas estas condiciones distintas nos permiten ver una porción de toda la variedad de microambientes tumorales y con ellas estudiar distintos tratamientos anticancerígenos y poder comparar. Los tratamientos elegidos han sido camptotecina, compuesto que nos sirve como control de la vía intrínseca de la apoptosis ya que se une a la topoisomerasa 1 bloqueando que está sea capaz de separarse del DNA durante la replicación y da lugar a la activación de la vía intrínseca de la apoptosis, y el TRAIL, ligandos que se unen a los receptores DR4 y DR5 y da lugar tanto a la activación de la vía extrínseca de la apoptosis mediante caspasa-3 como la activación de la vía intrínseca mediante la activación de Bid en t-Bid. Los ensayos se realizarán en 3 niveles, por un lado se realizarán análisis de time-lapse mediante microscopía donde se estudiarán los porcentajes de supervivencia y los tiempos de muerte de cada uno de los eventos apoptóticos en los tres medios en normoxia; respecto a los medios en hipoxia solo se realizará el análisis de los porcentajes de supervivencia ya que para realizar la grabación de un time-lapse es necesario romper el ambiente hipóxico durante 24 horas y daría resultados poco concluyentes. A partir de las diferencias tanto en tiempos como en porcentajes de supervivencia obtenidas en los distintos medios con distintas condiciones y tratamientos realizamos un análisis transcriptómico con el objetivo de relacionar los resultados obtenidos del primer ensayo con patrones de niveles de expresión derivados de las condiciones de cultivo. Por último, trasladaremos esa relación a modelos celulares a nivel proteómico donde, mediante inmunohistoquímica de células fijadas, previamente cultivadas en los 3 medios anteriormente mentados tanto en hipoxia como en normoxia, se analizarán a través de microscopía de fluorescencia y se medirán los niveles de fluorescencia entre las muestras para comprobar que las diferencias en los niveles de transcripción se traducen en diferencias en los niveles de proteínas in vivo. Con todos estos datos buscamos dar los primeros pasos en una línea de investigación basada en cómo las condiciones ambientales afectan a la eficacia de los tratamientos anticancerígenos y como los estudios que realizamos con TRAIL y camptotecina pueden extrapolarse a otros tratamientos permitiendo así facilitar la asignación de cada tratamiento a cada paciente según su microambiente tumoral y lo sensible que sea este a un tratamiento u otro. es_ES
dc.description.abstract [EN] The research in the discovery and improvement of new anticancer therapies has been, and continues to be, one of the most important areas in biomedical research. Within the range of current treatments, one of the aspects of greatest interest is the reduction in the adverse effects that can be generated in the patient, especially in the most commonly used treatments such as radiotherapy and chemotherapy. Advances in the field of personalized medicine seek to assign each patient the treatment that is most effective and, at the same time, causes the fewest adverse effects. One of the factors that influence the efficacy of anticancer treatments is the tumor microenvironment itself; microenvironments that are more hypoxic or more dependent on a certain amino acid can lead to an increase or decrease in the efficacy of treatments. The TFM project revolves around this concept and seeks to take the first steps towards the classification of patients according to their tumor microenvironment and thus be able to assign the appropriate treatment. For this purpose, we cultured HeLa cells in three different media, in complete medium that will act as a control, in medium supplemented with glucose, and in in medium without glucose supplemented with glutamine. In turn, all these media are cultured in both normoxia and hypoxia. All these different conditions allow us to see a portion of the whole variety of tumor microenvironments and with them to study different anticancer treatments and to be able to compare. The treatments chosen have been camptothecin, a compound that serves as a control of the intrinsic apoptosis pathway as it binds to topoisomerase 1 blocking it from being able to separate from DNA during replication and leads to the activation of the intrinsic apoptosis pathway, and TRAIL, ligands that bind to DR4 and DR5 receptors and result in both activation of the extrinsic pathway of apoptosis by caspase-3 and activation of the intrinsic pathway by activation of Bid on t-Bid. The assays will be performed at 3 levels, on the one hand time-lapse analyses will be performed by microscopy where the survival percentages and death times of each of the apoptotic events in the three media in normoxia will be studied; with respect to the media in hypoxia only the analysis of survival percentages will be performed since to perform the recording of a time-lapse it is necessary to break the hypoxic environment for 24 hours and would give inconclusive results. From the differences in both time and survival percentages obtained in the different media with different conditions and treatments, we will perform a transcriptomic analysis with the aim of relating the results obtained from the first assay with patterns of expression levels derived from the culture conditions. Finally, we will transfer this relationship to cell models at the proteomic level where, by immunohistochemistry of fixed cells, previously cultured in the 3 media mentioned above both in hypoxia and normoxia, will be analyzed by fluorescence microscopy and the fluorescence levels between samples will be measured to verify that the differences in transcript levels translate into differences in protein levels in vivo. With all these data we seek to take the first steps in a line of research based on how environmental conditions affect the efficacy of anticancer treatments and how the studies we performed with TRAIL and camptothecin can be extrapolated to other treatments, thus facilitating the assignment of each treatment to each patient according to their tumor microenvironment and how sensitive they are to one treatment or another. en_EN
dc.format.extent 60 es_ES
dc.language Español es_ES
dc.publisher Universitat Politècnica de València es_ES
dc.rights Reserva de todos los derechos es_ES
dc.subject HeLa es_ES
dc.subject TRAIL es_ES
dc.subject Camptotecina es_ES
dc.subject Metabolismo energético es_ES
dc.subject Hipoxia es_ES
dc.subject Normoxia es_ES
dc.subject Microambiente tumoral es_ES
dc.subject Camptothecin en_EN
dc.subject Energy metabolism en_EN
dc.subject Hypoxia en_EN
dc.subject Tumor microenvironment en_EN
dc.subject.classification BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR es_ES
dc.subject.other Máster Universitario en Biotecnología Biomédica-Màster Universitari en Biotecnologia Biomèdica es_ES
dc.title Efecto de las condiciones de cultivo en los programas de apoptosis intrínseco y extrínseco. es_ES
dc.type Tesis de máster es_ES
dc.rights.accessRights Abierto es_ES
dc.contributor.affiliation Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia es_ES
dc.description.bibliographicCitation Martín Sabuco, Á. (2021). Efecto de las condiciones de cultivo en los programas de apoptosis intrínseco y extrínseco. Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/169001 es_ES
dc.description.accrualMethod TFGM es_ES
dc.relation.pasarela TFGM\144266 es_ES


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