Role of the N-terminal Methionine in the biophysical properties of α-synuclein

Abstract

[EN] PD is a multifactorial pathology characterized by both motor and non-motor features; its development seems to be mainly linked to the formation of αSyn aggregates and their accumulation in dopaminergic neurons. αSyn is known to acquire an α-helical structure when interacting with biological membranes: the role of the four Met residues of αSyn in this type of interaction has not yet been investigated. Therefore, this study focuses on the analysis of the oxidized Met residues and the processing of the N-terminal one, as models to understand their role. Both αSyn and αSynOx are produced following procedures set up in the laboratory where the thesis work was performed. The production protocol for N-1-αSyn was not found in literature, therefore, several experiments are carried out to set-up the method. The best reaction conditions are yet found to have a very low yield. Due to the unfolding nature of αSyn, it is easier for the protease to cleave the entire polypeptide chain than to remove the first residue, therefore, it is complex to find an equilibrium where the protease cleaves the first residue without losing its specificity. Different sets of experiments are performed, firstly to characterize the three proteins from a chemical and conformational point of view; following, proteins were studied in the presence of two different membrane-mimetic systems: SDS and liposomes. The three proteins show α-helical structures upon encounter of the negatively charged surface in the presence of SDS and liposomes. Nevertheless, significant variations demonstrate that the N-terminal Met is not crucial for the anchoring of αSyn to the membrane, rejecting the last hypothesis on the field. These results are a starting point for further investigations related to the anchoring of αSyn to the cell membrane, crucial step in the PD pathogenesis.

[CA] PD és una patologia multifactorial caracteritzada tant per desordres motors com per altres no motors; el seu desenvolupament sembla estar principalment lligat a la formació d’agregats d’αSyn i la seua acumulació en les neurones dopaminèrgiques. αSyn adquireix estructura α-hèlice quan interacciona amb membranes biològiques: la importància dels quatre residus de metionina de la αSyn en aquest tipus d’interacció encara no ha estat investigada. És per això que aquest estudi es centra en l’anàlisi de l’oxidació dels residus de metionina i del processament de la metionina N-terminal, com a models per a entendre la seua importància. Tant l’αSyn com l’αSynOx es produeixen seguint els protocols establerts al laboratori on es va dur a terme el treball. El protocol de producció de la N-1-αSyn no es troba a la bibliografia, per la qual cosa es dissenyen diversos experiments per a determinar el millor mètode de producció. Fins i tot amb les condicions òptimes de producció, el rendiment de la reacció és molt baix. Açò es deu a que l’αSyn presenta una estructura de naturalesa desordenada que fa que la proteasa tinga més facilitat per tallar el polipèptid sencer que per fer-ho específicament amb la primera metionina. Per això, és complicat trobar un equilibri en el que la proteasa talla la metionina Nterminal sense perdre la especificitat. Diversos tipus d’experiments es duen a terme, primer per a caracteritzar les tres proteïnes des d’un punt de vista químic i conformacional; seguit d’un estudi en presència de dos tipus diferents de models de membrana biològica: micel·les de SDS i liposomes. Lestres proteïnes mostren una estructura α-hèlice quan interactuen amb superfícies carregades negativament en la presència de SDS o liposomes. No obstant això, variacions significatives demostren que la metionina N-terminal no és crucial per a l’àncora de la αSyn a la membrana, rebutjant l’última hipòtesi establerta en aquest camp. Aquests resultats són el punt d’inici per a futures investigacions relacionades amb l’àncora de l’αSyn a la membrana cel·lular, pas fonamental en la patogènesis del PD.