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Resumen:
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[ES] La epilepsia es un trastorno neurológico crónico común que representa una seria amenaza para la salud de los aproximadamente 50 millones de personas que la sufren, dado que los tratamientos disponibles no son completamente adecuados. En el que caso de este trabajo nos vamos a centrar en el Síndrome de Dravet (SD), una enfermedad rara que resulta en un tipo severo de epilepsia que comienza en la infancia y que está caracterizado por convulsiones mayoritariamente mioclónicas acompañadas de prolongadas crisis tónico-clónicas. El SD normalmente se manifiesta a lo largo del primer año de vida, a raíz de un cuadro febril. Posteriormente, se producirá un retraso en el desarrollo psicomotor y aparecerán trastornos de conducta. Además, el riesgo de muerte súbita inesperada en la epilepsia (SUDEP) asociado al síndrome es 15 veces mayor que en cualquier otra epilepsia que comience en la infancia.
Genéticamente, SD es provocado en más del 80% de los casos por mutaciones, normalmente de novo heterocigóticas, en el gen SCN1A que codifica para la subunidad alfa del canal Nav1.1. No obstante, aunque haya pacientes con mutaciones similares en SCN1A, pueden existir grandes diferencias tanto fenotípicas como en lo relacionado al resultado clínico, complicando así un efectivo pronóstico clínico.
Debido a las grandes diferencias fenotípicas mencionadas, nos hemos centrado en la hipótesis de la existencia de genes modificadores que influyen en la expresión de SCN1A aunque se segregan de manera independiente de este. Esta hipótesis es respaldada por otros estudios experimentales realizados con otras patologías genéticas, además de por dos trabajos realizados en este mismo grupo de investigación, y en los cuales voy a basar mi proyecto mediante la elección de seis posibles genes modificadores: CLCN1, CACNA1A, CHRNB2, KCNQ3, CHRNA4 y PAX6.
En este trabajo, hemos utilizado como modelo Drosophila melanogaster presentando la variación parabss1 del gen para, siendo este el homólogo del SCN1A en las moscas de la fruta. Los fenotipos epilépticos dados por la mutación bss1 no pueden ser reprimidos por completo mediante tratamiento farmacológico, un hecho muy similar al que sucede en los pacientes con DS. Nuestro proyecto se ha valido del silenciamiento génico vía RNA de interferencia y del sistema GAL4/ UAS para la obtención de fenotipos con la expresión de los genes de interés reprimida.
Los experimentos desarrollados comprenden una RT-qPCR para comprobar el nivel de expresión de los genes implicados -y así validar el funcionamiento del sistema GAL4/UAS-, un ensayo de vuelo, un ensayo de geotaxis negativo y un ensayo de locomoción a posteriori de uno de los fenotipos tras unos resultados interesantes.
De esta forma, hemos llegado a la conclusión de que los genes humanos CLCN1, KCNQ3 y PAX6 podrían utilizarse en el futuro en el diagnóstico y tratamiento del síndrome de Dravet.
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[EN] Epilepsy is a common chronic neurological disorder that represents a serious threat to the health of the approximately 50 million people who suffer from it worldwide, since the available treatments are not fully ...[+]
[EN] Epilepsy is a common chronic neurological disorder that represents a serious threat to the health of the approximately 50 million people who suffer from it worldwide, since the available treatments are not fully adequate. In our case, we will focus on Dravet Syndrome (DS), a severe type of child-hood onset epilepsy and is characterized by mostly myoclonic seizures accompanied by prolonged tonic-clonic seizures. DS usually manifests during the first year of life, following a febrile illness. Subsequently, there will be a delay in psychomotor development and behavioral disorders will appear. In addition, the risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP) associated with the syndrome is 15 times higher than in any other epilepsy beginning in infancy.
As for the genetic cause, this condition is caused in more than 80% of cases by mutations, usually de novo heterozygous, in the SCN1A gene that codes for the alpha subunit of the Nav1.1 channel. Furthermore, it has been shown that, although there are patients with similar mutations in the sodium channel gene that result in a similar loss of function, there may be large differences both phenotypically and in terms of clinical outcome, thus complicating an effective clinical prognosis.
Because of the large phenotypic differences mentioned above, we have focused on the hypothesis that there are modifier genes that influence SCN1A expression although they segregate independently of SCN1A. This hypothesis is supported by other experimental studies carried out with other genetic pathologies, as well as by two works carried out in this same research group, and on which I am going to base my project by choosing six possible modifier genes: CLCN1, CACNA1A, CHRNB2, KCNQ3, CHRNA4 and PAX6.
In this work, we have used as a model Drosophila melanogaster presenting the parabss1 variation of the para gene, being this the homologue of SCN1A in fruit flies. The epileptic phenotypes given by the bss1 mutation cannot be completely repressed by pharmacological treatment, a fact very similar to what happens in patients with DS. Our project has used gene silencing via RNA interference and the GAL4/UAS system to obtain phenotypes with repressed expression of fly homologues of the human genes of interest.
The experiments developed comprise a RT-qPCR to check the expression level of the genes involved -and thus validate the functioning of the GAL4/UAS system-, a flight test, a negative geotaxis test and a posteriori locomotion assay of one of the phenotypes following interesting results.
Thus, we have concluded that the human genes CLCN1, KCNQ3 and PAX6 could be used in the future in the diagnosis and treatment of Dravet syndrome.
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