Estudios para la identificación del gen diana del efector TAL pthA4-AT responsable del disparo de una respuesta hipersensible en Nicotiana benthamiana

Abstract

[ES] Los efectores TAL (transcription-activator like effectors) de Xanthomonas funcionan como factores de transcripción eucariotas en las células vegetales, jugando un papel en el desarrollo de enfermedades bacterianas mediante la inducción de genes de susceptibilidad del huésped. Los TALEs son translocados al núcleo de la célula vegetal y se unen a regiones promotoras de genes diana de las plantas, cuya transcripción facilita la colonización bacteriana. Algunas plantas han aprovechado este mecanismo de funcionamiento de los TALEs para generar señuelos que activan genes de resistencia. Estos genes contienen sitios de unión de efector TAL en sus regiones promotoras, y su activación desencadena una respuesta de resistencia en el huésped. El efector bacteriano PthA4AT, identificado en una variante de Xanthomonas citri, es reconocido por la planta Nicotiana benthamiana y desencadena una respuesta hipersensible (HR). Sin embargo, la corta longitud de este efector (7.5 repeticiones, cada una de ellas con afinidad por un nucleótido en el DNA) dificulta la identificación en el genoma de la planta del gen diana responsable de esta respuesta: la gran cantidad de posibles dianas requiere un estudio más detallado de las mismas, para identificar cuál de ellas dispara la HR.

El objetivo principal de este TFM es la identificación del gen diana de este TALE que desencadena la HR en N. benthamiana. Utilizando un kit de construcción modular de biología sintética para TALEs, se generarán TALEs extendidos de PthA4AT con más repeticiones, que se evaluarán para aparición de HR en Nicotiana benthamiana y se compararán con el efecto del PthA4AT natural, con el fin de aumentar la especificidad de secuencia requerida por el efector para disparar la respuesta hipersensible. Una vez se ha identificado un TALE derivado de PthA4AT con mayor especificidad de secuencia, se realizarán transformaciones transitorias de N. benthamiana con dicho TALE y mediante RNA seq se identificarán aquellos genes expresados en presencia del efector. En las secuencias promotoras de todos estos genes se buscará el sitio de unión del efector TAL, y los candidatos más prometedores serán clonados y ensayados en Nicotiana para la aparición de HR tras su expresión transitoria.

[EN] Transcription-activator like effectors (TALEs) of Xanthomonas function as eukaryotic transcription factors in plant cells, playing a central role in promoting bacterial disease by the induction of host susceptibility genes. TALEs are translocated into the plant cell nucleus and bind to the promoter regions of plant target genes whose transcription facilitate bacterial colonization. Some plants have taken advantage of this mechanism of TALEs to generate decoys that activate resistance genes. These genes contain TAL effector binding sites in their promoter regions, and their activation triggers a resistance response in the host. The bacterial effector PthA4AT, identified in a variant of Xanthomonas citri, is recognized by Nicotiana benthamiana and triggers a hypersensitive response (HR). However, the short length of this effector (7.5 repeats, each with affinity for a nucleotide in DNA) makes it difficult to identify the target gene responsible for this response in the plant genome: the large number of possible targets requires a more detailed study of them, to identify which one triggers the HR.

The main objective of this TFM is the identification of the target gene of this TALE that triggers HR in N. benthamiana. Using a modular construction kit of synthetic biology for TALEs, extended TALEs of PthA4AT with more repeats will be generated, which will be evaluated for the appearance of HR in Nicotiana benthamiana and will be compared with the effect of natural PthA4AT, in order to increase the specificity of sequence required by the effector to trigger the hypersensitive response. Once a TALE derived from PthA4AT with greater sequence specificity has been identified, transient transformations of N. benthamiana will be carried out with this TALE and those genes expressed in the presence of the effector will be identified by RNA-seq. The promoter sequences of all these genes will be searched for the TAL effector binding site, and the most promising candidates will be cloned and tested in Nicotiana for the appearance of HR after transient expression.