Development and Optimization of Experimental Biosensing Protocols Using Porous Optical Transducers

Abstract

[ES] Los biosensores son dispositivos analíticos con aplicabilidad en diferentes campos y con numerosas ventajas frente a otros métodos analíticos convencionales, como son el uso de pequeños volúmenes de muestra y reactivos, su sensibilidad y su rápida respuesta, sin necesidad de pretratamiento de la muestra, equipos caros o personal especializado. Sin embargo, se trata de un campo de investigación relativamente nuevo en el que todavía queda mucho camino por andar.

Esta Tesis doctoral pretende aportar un granito de arena a este campo de conocimiento mediante el estudio del potencial de diferentes materiales porosos como transductores para el desarrollo de biosensores ópticos con respuesta en tiempo real y sin marcajes. Los materiales propuestos van desde aquellos artificialmente sintetizados, como silicio poroso (SiP), nanofibras (NFs) poliméricas o membranas poliméricas comerciales, hasta materiales naturales con propiedades fotónicas que todavía no habían sido explotadas para el sensado, como son los exoesqueletos de biosílice de diatomeas. Todos ellos tienen en común la simplicidad en su obtención, evitando costosos y laboriosos procesos de nanofabricación. Para su estudio, se analizará su respuesta óptica y, en aquellos casos en los que ésta permita llevar a cabo experimentos de detección, se desarrollarán estrategias para su biofuncionalización y su implementación en experimentos de biosensado.

En el caso del SiP y las NFs se han optimizado los parámetros de fabricación para obtener una respuesta óptica adecuada que permita su interrogación. A continuación, se ha llevado a cabo su biofuncionalización empleando métodos covalentes y no covalentes, así como diferentes bioreceptores (aptámeros de ADN y anticuerpos) para estudiar su potencial y sus limitaciones como biosensores. En el caso de las membranas comerciales y el exoesqueleto de sílice de diatomeas, se ha caracterizado su respuesta óptica y se han llevado a cabo experimentos de sensado de índice de refracción para estudiar su sensibilidad. Así mismo, se ha desarrollado un método de funcionalización de la superficie del exoesqueleto de diatomeas basado en el uso de polielectrolitos catiónicos.

Como resultado, se ha demostrado el potencial tanto de NFs para el desarrollo de biosensores, como el de membranas comerciales para sensores cuya aplicación no requiera una elevada sensibilidad pero sí un bajo coste. Además, se ha puesto de manifiesto el gran potencial del exoesqueleto de diatomeas para el desarrollo de sensores basados en su respuesta óptica. Por el contrario, las limitaciones encontradas en el desarrollo de biosensores basados en SiP han evidenciado la necesidad de un estudio riguroso y la optimización de la estructura de materiales porosos previamente a ser usados en (bio)sensado.

[CA] Els biosensors són dispositius analítics amb aplicabilitat en diferents camps i amb nombrosos avantatges enfront d'altres mètodes analítics convencionals, com són l'ús de xicotets volums de mostra i reactius, la seua sensibilitat i la seua ràpida resposta, sense necessitat de pretractament de la mostra, equips cars o personal especialitzat. No obstant això, es tracta d'un camp d'investigació relativament nou en el qual encara queda molt camí per fer.

Aquesta Tesi doctoral pretén aportar el seu òbol a aquest camp de coneixement mitjançant l'estudi del potencial de diferents materials porosos com a transductors per al desenvolupament de biosensors òptics amb resposta en temps real i sense marcatges. Els materials proposats van des d'aquells artificialment sintetitzats, com a silici porós (SiP), nanofibras (NFs) polimèriques o membranes polimèriques comercials, fins a materials naturals amb propietats fotòniques que encara no havien sigut explotades per al sensat, com són els exoesquelets de biosílice de diatomees. Tots ells tenen en comú la simplicitat en la seua obtenció, evitant costosos i laboriosos processos de nanofabricació. Per al seu estudi, s'analitzarà la seua resposta òptica i, en aquells casos en els quals aquesta permeta dur a terme experiments de detecció, es desenvoluparan estratègies per a la seua biofuncionalizació i la seua implementació en experiments de biosensat.

En el cas del SiP i les NFs s'han optimitzat els paràmetres de fabricació per a obtenir una resposta òptica adequada que permeta la seua interrogació. A continuació, s'ha dut a terme la seua biofuncionalizació emprant mètodes covalents i no covalents, així com diferents bioreceptors (aptàmers d'ADN i anticossos) per a estudiar el seu potencial i les seues limitacions com a biosensors. En el cas de les membranes comercials i l'exoesquelet de sílice de diatomees, s'ha caracteritzat la seua resposta òptica i s'han dut a terme experiments de sensat d'índex de refracció per a estudiar la seua sensibilitat. Així mateix, s'ha desenvolupat un mètode de funcionalizació de la superfície de l'exoesquelet de diatomees basat en l'ús de polielectròlits catiònics.

Com a resultat, s'ha demostrat el potencial tant de NFs per al desenvolupament de biosensors, com el de membranes comercials per a sensors amb una aplicació que no requerisca una elevada sensibilitat però sí un baix cost. A més, s'ha posat de manifest el gran potencial de l'exoesquelet de diatomees per al desenvolupament de sensors basats en la seua resposta òptica. Per contra, les limitacions trobades en el desenvolupament de biosensors basats en SiP han evidenciat la necessitat d'un estudi rigorós i l'optimització de l'estructura dels materials porosos prèviament a ser usats en (bio)sensat.

[EN] Biosensors are analytical devices with application in diverse fields and with several advantages relative to other conventional methods, such as the use of small volumes of sample and reagents, their sensitivity and their fast response, without the need of the sample pretreatment, expensive equipments or specialised technicians. Nevertheless, this is a relatively new research field in which there is a long way to go yet.

This doctoral Thesis aims at doing its bit to this field of knowledge by studying the potential of different porous materials as transducers for the development of real-time and label-free optical biosensors. The proposed materials range from those artificially synthesised, such as porous silicon (pSi), polymeric nanofibres (NFs) or commercial polymeric membranes, to natural materials with photonic properties that had not been exploited for sensing yet, such as biosilica exoskeletons of diatoms. All of them have in common its simple production, avoiding expensive and laborious nanofabrication processes. For their study, their optical response will be analysed and, in those cases in which such optical response allows performing detection experiments, strategies for their biofunctionalisation and their implementation in biosensing experiments will be developed as well.

Regarding pSi and NFs, the fabrication parameters were optimised to get a suitable optical response for their interrogation. Afterwards, their surface functionalisation was carried out by covalent and non-covalent methods, as well as different bioreceptors (DNA aptamers and antibodies), to study their potential and their constraints as biosensors. Concerning commercial membranes and the biosilica exoskeleton of diatoms, their optical response was characterised and refractive index sensing experiments were carried out to study their sensitivity. Additionally, a biofunctionalisation method for the surface of the diatoms exoskeleton was developed based on the use of cationic polyelectrolytes.

As a result, it was demonstrated the potential of NFs for the development of biosensors, as well as the potential of commercial membranes for developing sensors for an application that does not require a high sensitivity but a low cost. Furthermore, the great potential of biosilica exoskeleton of diatoms for the development of sensors based on their optical response has been revealed. By contrast, the constraints found in the development of pSi illustrate the importance of an accurate study and optimisation of porous materials structure before using them for (bio)sensing.