Análisis funcional de las proteínas ORF3a, ORF6 y Orf7a del SARS-CoV-2 en levadura

Abstract

[ES] El SARS-CoV-2 (¿severe acute respiratory syndrome coronavirus 2¿) es el agente causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que ha provocado una pandemia sin precedentes en todo el mundo. El gran genoma de ARN de SARS-CoV-2 contiene la información de varias proteínas accesorias. Aunque estos pequeños ORF no son estrictamente necesarios para la infección o la replicación viral, se cree que desempeñan papeles importantes en la modulación de las funciones biológicas de las células huésped, como la respuesta al estrés o la apoptosis. Aquí investigamos las funciones biológicas de tres de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2, ORF3a, ORF6 y ORF7a en levadura como modelo celular. Construiremos un conjunto de plásmidos para la expresión constitutiva e inducible por galactosa de cada proteína viral, tanto en un número bajo como en un alto número de copias. Las fusiones de las proteínas ORF con el epítopo flag o con GFP permitirán su detección inmunológica en extractos de levadura o su localización intracelular por microscopía de fluorescencia confocal. Los experimentos de tinción conjunta con núcleos, vacuolas, retículo endoplásmico o mitocondrias revelarán aún más los sitios intracelulares de acción de estas proteínas. El efecto de la sobreexpresión de cada ORF sobre la viabilidad, proliferación, adaptación al estrés y muerte celular apoptótica se cuantificará para las diferentes dosis. En conjunto, desarrollaremos herramientas moleculares para estudiar las funciones biológicas de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 para comprender mejor cómo estas proteínas manipulan las funciones internas de las células huésped.

[EN] : The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the causative agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19), which has caused an unprecedented pandemic all over the world. The large RNA genome of SARS-CoV-2 contains the information of several accessory proteins. Although these small ORFs are not strictly needed for viral infection or replication, they are thought to play important roles in the modulation of the host cells biological functions such as the stress response or apoptosis. Here we investigate the biological functions of three of the SARS-CoV-2 accessory proteins, ORF3a, ORF6 and ORF7a in yeast as the cellular model. We will construct a set of plasmids for the galactose-inducible and constitutive expression of each viral protein, both at low copy and high copy number. Fusions of the ORF proteins with the flag epitope or with GFP will allow their immunological detection in yeast extracts or their intracellular localization by confocal fluorescence microscopy. Co-staining experiments with nuclei, vacuoles, endoplasmic reticulum or mitochondria will further reveal the intracellular sites of action for these proteins. The effect of ORF overexpression on viability, proliferation, stress adaptation and apoptotic cell death will be quantified for the different ORF doses. Taken together, we will develop molecular tools to study the biological functions of SARS-CoV-2 accessory proteins to better understand how these proteins manipulate the host cells internal functions.