Clonación y expresión de proteínas del virus del bronceado del tomate (TSWV) en plantas de Nicotiana benthamiana mediante un vector de expresión derivado del virus del grabado del tabaco (TEV)

Abstract

[ES] El virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV) está considerado como una de las virosis más destructivas de la agricultura actual, siendo capaz de infectar a una gran variedad de cultivos hortícolas, ornamentales y especies de malas hierbas. En España, la enfermedad del bronceado provoca grandes pérdidas económicas en los cultivos de tomate (Solanum lycopersicum) y pimiento (Capsicum ssp.), produciéndose la mayor incidencia en toda la zona mediterránea y en el archipiélago canario. El método de control más eficaz es el desarrollo de variedades con genes de resistencia. La incorporación en cultivares de tomate del gen Sw-5 y en pimiento del gen Tsw, procedentes de Lycopersicon peruvianum y Capsicum chinense, respectivamente, son los que más éxito han tenido dado su amplio espectro de acción y se han estado utilizando desde el año 1996 en un gran número de variedades comerciales, lo que ha supuesto una disminución importante de las pérdidas económicas. Sin embargo, debido a la elevada diversidad y a la gran adaptabilidad del TSWV, han aparecido numerosos aislados que superan dichas resistencias. Experimentos anteriores realizados in vitro permitieron localizar los determinantes genéticos responsables de la rotura de la resistencia conferida por el gen Sw-5 en las posiciones aminoacídicas 118 y 120 de la proteína NSm del virus. En el caso del pimiento, los estudios realizados hasta el momento no han permitido determinar si la superación de esta resistencia está causada por una serie de sustituciones indeterminadas en la proteína NSs o en la proteína N. En estudios anteriores se intentaron expresar las proteínas del TSWV usando un vector basado en el virus X de la patata (Potato virus X, PVX), pero las construcciones no fueron estables cuando se inocularon en plantas de tomate. En este vector el gen exógeno es expresado a partir de un promotor viral fuerte (duplicado), lo que facilita la recombinación homóloga entre los dos promotores idénticos, provocando la pérdida de una copia del mismo y la secuencia exógena clonada entre ambos. Para tratar demostrar in vivo dónde se localizan los determinantes genéticos responsables de la superación de ambas resistencias y superar las limitaciones que presenta el empleo del vector viral basado en el PVX, pretendemos desarrollar un sistema genético basado en la expresión de proteínas del TSWV usando otro vector viral basado en el virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV) que tiene una estrategia de expresión genética diferente consistente en la expresión de una única poliproteína. Por tanto, poner a punto el sistema de agroinoculación y evaluar la cantidad de información genética que se puede expresar a partir de dicho vector, constituyeron los objetivos del presente Trabajo Fin de Máster. Como resultado de este trabajo se ha conseguido clonar el gen que codifica la proteína de movimiento NSm de dos aislados diferentes del TSWV en el vector de expresión derivado del TEV y se dispone de los genes que codifican las proteínas NSs y N en un vector intermedio. La agroinoculación realizada con el clon infeccioso derivado del TEV permitió infectar sistémicamente plantas de N. benthamiana. Sin embargo, los mismos ensayos realizados con un clon en el que se ha insertado la secuencia del gen que codifica la proteína NSm no desencadenó la infección sistémica. Es sabido que este tipo de plásmidos son a menudo inestables cuando son propagados en bacteria como E. coli, siendo frecuentes durante el cultivo alteraciones de secuencia tales como mutaciones puntuales y delecciones Será necesario realizar nuevos ensayos de agroinoculación con diferentes clones recombinantes para tratar de conseguir una expresión satisfactoria de las diferentes proteínas exógenas.

[EN] Tomato spotted wilt virus (TSWV) is considered one of the most destructive viruses in the current agriculture, being able to infect a wide range of horticultural crops, ornamental, and weed species. In Spain, the spotted wilt disease causes severe economic losses in tomato (Solanum lycopersicum) and pepper crops (Capsicum ssp.), with a bigger impact in the whole Mediterranean area and in the Canary Islands. The most effective control method consists of developing varieties with resistance genes. The incorporations of gene Sw-5 in tomato cultivars and gene Tsw in pepper ones, coming from Lycopersicon peruvianum and Capsicum chinense respectively, have been the most successful choices due to their large range of action. Because of that, they have been applied since 1996 to a big number of commercial varieties, which has lead to a significant reduction of economic losses. However, because of the high diversity and adaptability of the TSWV, several isolates that overcome such resistance have appeared. With previous in vitro experiments, the genetic determinants responsible for breakage resistance conferred by the gene Sw-5 were located at the aminoacidic positions 118 and 120 of the NSm protein. Regarding the pepper, the experiments didn¿t contribute to determine if the overcoming of the resistance is caused by a series of indetermined substitutions in the NSs or in the N protein. In previous tests, a vector based on the virus X of the potato (Potato virus X, PVX) was used to try to set forth the TSWV proteins. The constructions were not stable when they were inoculated to tomato plants though. In this vector the exogenous gene is represented by a strong viral promoter (duplicated), that makes easier the homologous recombination between the two identical promoters, resulting in the loss of one of the copies of the viral and the exogenous sequence between the two promoters. In order to prove in vivo where the genetic determinants responsible of overcoming both resistances are and get over the limitations added by the use of the viral vector based in the PVX, the aim is to develop a genetic system built on the expression of TSWV proteins using another viral vector derived on the Tobacco etch virus (TEV). Therefore, making the agroinoculation system ready and evaluating the genetic information that can be expressed with this vector, will constitute the targets of this Master Thesis. As a result, the gene that encodes the movement protein NSm of two different isolates has been successfully cloned in the expression vector derived from the TEV; and the genes that encoded the NSs and N proteins are available in an intermediate vector. The agroinoculation performed with the infectious clone derived from the TEV, enabled the systematic infection of the N. benthamiana plants. Nonetheless, the tests carried out with a clone, to which the gene that encodes the NSm protein has been inserted, did not bring systematic infection. It is known, these plasmids are often unstable when propagated in bacteria like E. coli, and sequence alterations, such as point mutations and deletions, are produced during culture. New agroinoculation tests with different recombinant clones will be needed