Optimization of a φC31 integrase-controlled genetic memory switch in Nicotiana benthamiana

Abstract

[EN] Plant synthetic biology is a young and constantly growing field of science that offers to society a wide variety of genetic tools to modify and to harness plant metabolic complexity for human benefit. To date, several genetic tools have been developed and implemented in plant systems for its use in future agriculture issues. One fascinating example is the development of the φC31 integrase- controlled genetic memory switch, which allows to transcriptionally regulate the activation of any two genes of interest by simply using a recombinase protein from phage φC31. Other alluring plant genetic devices are the dCas9-based gene regulators, which take advantage of dCas9 protein variant that can bind target DNA sequences but not cleave them. By fusing transcriptional activators or repressors to these dCas9 proteins and using the appropriate RNA guides it is able to regulate the expression of any gene of interest. In the present research of Master‘s thesis, we have optimized the φC31 integrase protein dose necessary for the optimal switch activation, using two transgenic Nicotiana benthamiana plant lines carrying different switch constructs. In these lines, we transiently expressed the φC31 integrase under different conditions, testing four promoters of growing strengths and three Agrobacterium tumefaciens optical densities (OD600), with the aim of finding out the optimal conditions for integrase expression and subsequent switch activation. Once the optimals conditions were set, we designed two new memory switches that combined switch device architecture with the regulatory potential of a dCas9-based transcriptional activation system called dCasEV2.1. Regulating dCasEV2.1 system through switch tool overcame the limit of controlling just two genes of interest and allowed us to regulate different downstream genes by choosing an appropriate RNA guide. New switch versions were functionally characterized in N. benthamiana WT plants by transient expression and subsequent molecular assays including bioluminiscence and fluorescence assays, analysis of gene expression through quantitative RT-PCR or analysis of volatile Lepidopteran sex pheromones by GC-MS.

[ES] La biología sintética vegetal es un campo de la ciencia joven y en constante crecimiento que ofrece a la sociedad una amplia variedad de herramientas genéticas para modificar y aprovechar las complejidad metabólica para el beneficio humano. Hasta la fecha, varias herramientas genéticas han sido desarrollado e implementado en sistemas de plantas para su uso en futuras cuestiones agrícolas. Un ejemplo fascinante es el desarrollo de la integrasa φC31- interruptor de memoria genética controlada, que permite regular transcripcionalmente la activación de cualquiera de los dos genes de interés simplemente usando una proteína recombinasa de fago φC31. Otros dispositivos genéticos de plantas atractivos son el gen basado en dCas9 reguladores, que aprovechan la variante de proteína dCas9 que puede unirse al ADN objetivo secuencias pero no escindirlas. Al fusionar activadores o represores transcripcionales para estas proteínas dCas9 y utilizando las guías de ARN apropiadas es capaz de regular la expresión de cualquier gen de interés. En la presente investigación de tesis de maestría, han optimizado la dosis de proteína integrasa φC31 necesaria para el cambio óptimo activación, utilizando dos líneas de plantas transgénicas Nicotiana benthamiana que llevan diferentes cambiar construcciones. En estas líneas, expresamos transitoriamente la integrasa φC31 bajo diferentes condiciones, probando cuatro promotores de fuerza de crecimiento y tres Agrobacterium tumefaciens densidades ópticas (OD600), con el objetivo de conocer la condiciones óptimas para la expresión de la integrasa y la posterior activación del interruptor. Una vez se establecieron las condiciones óptimas, diseñamos dos nuevos interruptores de memoria que arquitectura de dispositivo de conmutación combinada con el potencial regulatorio de un dCas9 basado sistema de activación transcripcional llamado dCasEV2.1. Regulación del sistema dCasEV2.1 a través de la herramienta de cambio superó el límite de controlar solo dos genes de interés y nos permitió regular diferentes genes aguas abajo eligiendo un ARN apropiado guía. Se caracterizaron funcionalmente nuevas versiones de interruptores en N. benthamiana WT plantas por expresión transitoria y ensayos moleculares posteriores, incluidos ensayos de bioluminiscencia y fluorescencia, análisis de la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa o análisis de feromonas sexuales de lepidópteros volátiles por GC-MS.