Desarrollo de embriones de conejo sobre matriz oviductal y medio condicionado por células oviductales. Efectos sobre la viabilidad y el crecimiento postnatal.

Abstract

[ES] Los embriones producidos in vitro alteran su desarrollo con repercusiones en su fisiología que pueden comprometer su viabilidad inmediata o introducir cambios que serán observables durante su etapa postnatal. Estas alteraciones son el resultado del proceso adaptativo que los embriones desencadenan para hacer frente al ambiente y composición de los medios de cultivo. El objetivo del estudio es evaluar nuevos sistemas de cultivo para embriones de conejo en estadio de 2 células que ayuden a paliar los efectos adversos del cultivo. Para ello se estudió, en un primer experimento, un sistema de co-cultivo basado en la reconstrucción de un epitelio oviductal homólogo sobre dos tipos de hidrogeles (colágeno tipo I y matriz oviductal de 24h) y dos medios de cultivo (medio base que contaba con piruvato y lactato sódico y un segundo medio que fue suplementado adicionalmente con EGF e ITS). En el segundo experimento, se utilizó el medio base condicionado con el cultivo previo de dos tipos de epitelio oviductal que diferían en la edad desde que se indujo la ovulación (48h y 72h). En ambos experimentos los embriones se obtuvieron de conejas donantes 24 horas después de su inseminación (IA) e inducción de la ovulación con acetato de buserelina. Las conejas donantes habían sido tratadas 72h previas a la IA con coriofolitropina alfa para incrementar su respuesta ovulatoria. Las condiciones y periodo de cultivo fueron iguales en ambos experimentos, 38.0ºC, 5% CO2, humedad a saturación y 72h de cultivo. Al finalizar el cultivo se catalogó el estadio de desarrollo alcanzado por los embriones.

En el primer experimento, los embriones fueron transferidos a conejas receptoras inducidas a ovular 60 horas antes en grupos de entre 15 y 20 embriones en cada hembra. Además, se prepararon dos grupos control de conejas, uno de ellos por IA con el fin de evaluar el impacto del cultivo y transferencia en el crecimiento postnatal y otro con conejas transferidas con embriones en estadio de mórula no cultivados con el fin de observar el efecto del cultivo sobre la supervivencia y el crecimiento postnatal. En el segundo bloque experimental, en el que se estudiaron los medios condicionados con los epitelios oviductales de 48h y 72h, se evaluó además del desarrollo in vitro, la expresión de los genes de pluripotencialidad (OCT4 y SOX2) como parámetros de calidad embrionaria.

El cultivo embrionario en los medios condicionados produjo un retraso en el desarrollo embrionario temprano, así como baja expresión de los genes analizados. Los distintos hidrogeles con el cultivo de ROECs combinados con los medios de cultivo indujeron un retraso en el desarrollo embrionario temprano produciendo una reducción de la tasa de supervivencia fetal, principalmente en los grupos en los que se utilizó medio específico para el cultivo epitelial suplementado con EGF e ITS. Sin embargo, los análisis del desarrollo postnatal mostraron pesos superiores para los grupos en los que se utilizó este medio, mientras que en el resto de los grupos los pesos fueron comparables a los controles. No se observó ninguna alteración en el desarrollo postnatal.

[EN] Embryos produced in vitro alter their development with repercussions in their physiology that can compromise their immediate viability or introduce changes that will be observable during their postnatal stage. These alterations are the result of the adaptive process that embryos trigger to cope with the environment and composition of the culture media. The aim of the study is to evaluate new culture systems for 2-cell stage rabbit embryos that help to mitigate the adverse effects of culture. For this purpose, in a first experiment, a co-culture system based on the reconstruction of a homologous oviductal epithelium on two types of hydrogels (type I collagen and 24h oviductal matrix) and two culture media (base medium containing pyruvate and sodium lactate and a second medium additionally supplemented with EGF and ITS) was studied. In the second experiment, the base medium was used conditioned with the previous culture of two types of oviductal epithelium that differed in their age since ovulation was induced (48h and 72h). In both experiments embryos were obtained from donor rabbits 24h after insemination (AI) and ovulation induction with buserelin acetate. Donor rabbits had been treated 72h before AI with coriofollitropin alpha to increase their ovulatory response. The conditions and culture period were the same in both experiments, 38.0ºC, 5% CO2, saturation humidity and 72h of culture. At the end of the culture, the stage of development reached by the embryos was catalogued.

In the first experiment, embryos were transferred to recipient rabbits induced to ovulate 60 hours earlier in groups of 15 to 20 embryos in each female. In addition, two control groups of rabbits were prepared, one of them by AI to evaluate the impact of culture and transfer on postnatal growth and the other with transferred rabbits with uncultured morula stage embryos in order to observe the effect of culture on survival and postnatal growth. In the second experiment, in which conditioned media with 48h and 72h oviductal epithelia were studied, the expression of pluripotency genes (OCT4 and SOX2) was evaluated as parameters of embryo quality in addition to in vitro development.

Embryo culture in the conditioned media produced a delay in early embryonic development, as well as low expression of the analysed genes. The different hydrogels with ROECs culture combined with the culture media induced a delay in early embryonic development producing a reduction in the foetal survival rate, mainly in the groups in which specific medium for epithelial culture supplemented with EGF and ITS was used. However, postnatal developmental analyses showed higher weights for the groups in which this medium was used, while in the other groups the weights were comparable to the controls. No alteration in postnatal development was observed.