Desarrollo de embriones de conejo con hidrogeles. Efectos sobre la viabilidad y el crecimiento postnatal

Abstract

[ES] Los hidrogeles derivados de la matriz extracelular (MEC) de los tejidos y órganos reproductivos están emergiendo como sistemas prometedores para definir mejores condiciones de cultivo para embriones. Sin embargo, dado que estas técnicas se aplican durante el desarrollo embrionario temprano y que éste es un periodo sensiblemente crítico, los medios y las técnicas utilizadas pueden provocar alteraciones en el desarrollo in vitro e in vivo que deben ser estudiadas. El objetivo del presente estudio fue la evaluación de un hidrogel comercial de colágeno I y de hidrogeles obtenidos del tejido oviductal sobre el desarrollo in vitro de conejo y su viabilidad posterior. Los hidrogeles derivados de los oviductos fueron preparados mediate un protocolo de descelularización con soluciones de los detergentes (sodium dodecyl sulphate ¿SDS- y Tritón X-100) y DNasa 1 (grado II de páncreas bovino). El trabajo se estructuró en dos bloques experimentales, el primero en el que se estudió el efecto del medio de cultivo (DMEM/F12 50/50) suplementado con lactato y piruvato y, del tipo de hidrogel, colágeno tipo I (Col I) y de un hidrogel de matriz oviductal de conejas inducidas a ovular 24h (Mov 24h) sobre el desarrollo embrionario in vitro e in vivo. El segundo, se evaluó el efecto de la suplementación del medio de cultivo (DMEM/F12 50/50 suplementado con lactato y piruvato) con un 10% de matriz oviductal de conejas inducidas a ovular 48 o 72 horas sobre el desarrollo embrionario in vitro y sobre la expresión génica de OCT4 u SOX2. En ambos experimentos las conejas donantes fueron superovuladas con Coriofolitropin alfa y recuperados los embriones 24h después de ser inseminadas y fueron asignados a los diferentes grupos experimentales y cultivados durante 72h a 38ºC, 5%CO2 y humedad a saturación. La viabilidad in vivo y el crecimiento postnatal de los embriones cultivados del primero experimento fue estimada mediante la transferencia de 452 embriones sobre 30 conejas receptoras. Además, se realizó un análisis proteómico de los diferentes hidrogeles producidos a partir de las matrices oviductales de 24, 48h y 72h y utilizados en este trabajo. Los resultados obtenidos mostraron que el cultivo in vitro de embriones de conejo de 2 células en el medio cultivo suplementado con EGF e ITS o cultivados sobre uno u otro tipo de hidrogel retrasaron el desarrollo embrionario. Además, la viabilidad embrionaria in vivo fue baja entre un 9 y un 13% consecuencia directa del cultivo embrionario durante 72h. El peso de los gazapos al nacimiento nacidos del cultivo no se vio afectado frente a los controles utilizados, inseminación artificial y transferencia embrionaria. Pero, si pudo observarse que el peso al destete de los gazapos nacidos del medio suplementado con EGF e ITS y del cultivo sobre el Gel Col I fue mayor a los nacidos por inseminación artificial. El efecto negativo de los prehidrogeles sobre el desarrollo in vitro pudo ser comprobado en el segundo experimento en el que la suplementación del medio de cultivo con 10% de los prehidrogeles de 48 y 72h, sugiriendo la presencia de sustancia embriotóxicas en su composición. El análisis proteómico detectó 209 proteínas, mostrando que 3 de ellas tenían una abundancia diferente entre los prehidrogeles 24 y 48 h y otras tres entre el de 24 y 72 horas, 48 y 72 h mostraron un proteoma idéntico. De total de las proteínas encontradas en los prehidrogeles, el 58% de las proteínas eran matrisomicas.

[EN] Hydrogels derived from the extracellular matrix (ECM) of reproductive tissues and organs are emerging as promising systems to define better culture conditions for embryos. However, given that these techniques are applied during early embryonic development and that this is a sensitively critical period, the media and techniques used can cause alterations in vitro and in vivo development that must be studied. The objective of the present study was the evaluation of a commercial hydrogel of collagen I and of hydrogels obtained from oviductal tissue on the in vitro development of rabbits and their subsequent viability. The hydrogels derived from the oviducts were prepared through a decellularization protocol with detergent solutions (sodium dodecyl sulphate -SDS- and Triton X-100) and DNase 1 (grade II from bovine pancreas). The work was structured in two experimental blocks, the first in which was studied the effect of the culture medium (DMEM/F12 50/50) supplemented with lactate and pyruvate and, of the hydrogel type, collagen type I (Col I) and a hydrogel of the oviductal matrix of rabbits induced to ovulate 24h (Mov 24h) on embryonic development in vitro and in vivo. The second, was evaluated the effect of supplementation of the culture medium (DMEM/F12 50/50 supplemented with lactate and pyruvate) with 10% oviductal matrix of rabbits induced to ovulate at 48 or 72 hours on embryonic development in vitro and on gene expression of OCT4 or SOX2. In both experiments, the donor rabbits were superovulated with Corifollitropin alfa and the embryos recovered 24h after being inseminated and were assigned to the different experimental groups and cultured for 72h at 38ºC, 5%CO2 and saturated humidity. In vivo viability and postnatal growth of cultured embryos from the first experiment was estimated by transferring 452 embryos onto 30 recipient rabbits. In addition, a proteomic analysis of the different hydrogels produced from the 24, 48h and 72h oviductal matrices and used in this work was performed. The results obtained showed that the in vitro culture of 2-cell rabbit embryos in the culture medium supplemented with EGF and ITS or cultured on one or another type of hydrogel delayed embryonic development. In addition, in vivo embryo viability was low, between 9 and 13%, a direct consequence of embryo culture for 72 hours. The weight of the rabbits at birth born from the culture was not affected compared to the controls used, artificial insemination and embryo transfer. However, it was observed that the weaning weight of the rabbits born from the medium supplemented with EGF and ITS and from the culture on Gel Col I was higher than those born by artificial insemination. The negative effect of the prehydrogels on in vitro development could be verified in the second experiment in which the culture medium was supplemented with 10% of the prehydrogels at 48 and 72h, suggesting the presence of embryotoxic substances in its composition. Proteomic analysis detected 209 proteins, showing that 3 of them had a different abundance between 24 and 48 h prehydrogels and another three between 24 and 72 h, 48 and 72 h showed an identical proteome. Of the total proteins found in the prehydrogels, 58% of the proteins were matrisomal.