Generación y caracterización de un modelo CRISPR-Cas9 del Síndrome por deficiencia de CDKL5 en Drosophila melanogaster.

Abstract

[ES] La epilepsia es un problema neurológico responsable de un número considerable de las muertes mundiales y que afecta a más de 50 millones de personas. Además, cada año se diagnostican unos 5 millones de casos. Concretamente, se estima que entre 4 y 10 de cada 1000 personas presentan epilepsia activa, con ataques continuos. En nuestro trabajo, nos vamos a centrar en el Síndrome por deficiencia de CDKL5 (CDD, por sus siglas en inglés CDKL5 deficiency Disorder), un trastorno genético ligado al cromosoma X que provoca la aparición temprana de alteraciones graves del desarrollo neurológico. También en muchos casos acarrea convulsiones epilépticas de difícil control. Solo en España existen 29 casos diagnosticados, pero se sospecha que podría haber cerca de 400 personas, la mayoría mujeres por su modo de herencia y letalidad asociada al varón.

El gen CDKL5 es el responsable de la síntesis de una proteína necesaria para el desarrollo y función normales del cerebro. La mayoría de las variantes patogénicas del gen CDKL5 se producen espontáneamente e involucran una proteína no funcional o una ausencia completa de la misma. Se ha observado que estas variantes disfuncionales no se transmiten de padres a hijos, por lo que se originan de novo. Sin embargo, hay casos descritos de hermanos afectados por la misma versión de la proteína.

En este trabajo, se ha utilizado como modelo de la enfermedad a Drosophila melanogaster, con el fin de simular y corroborar sus síntomas, así como comprender las bases génicas y moleculares del trascurso del síndrome. El estudio se ha centrado en un gen candidato único en moscas, CG7236, y que se cree que es equivalente a la familia de genes CDKL en humanos, por lo que se propone renombrarlo a Cdkl. Para ello, los experimentos realizados han sido, en primer lugar, cruces con moscas que presentan un gen CRISPR en su segundo cromosoma con moscas que poseen la proteína Cas-9 en el tercero. Mediante cruces posteriores para obtener mutaciones en la línea germinal de la progenie, se han obtenido cepas de D. melanogaster con características fenotípicas diferenciales respecto a las moscas control de la variante Canton-S, como convulsiones o deficiencias locomotoras. Esto se comprobó en ensayos de convulsión y geotaxis negativa. Posteriormente, mediante extracción de ADN genómico de las moscas mutantes y PCR del fragmento de Cdkl, se comprobó la presencia de bandas de diversos tamaños en un gel de agarosa y se secuenció.

Así pues, este proyecto se ha valido del sistema CRISPR-Cas9 para generar una mosca mutante del Síndrome por deficiencia CDKL5 que podría ser la base para estudiar la enfermedad en humanos y encontrar tratamientos satisfactorios.

[EN] Epilepsy is a neurological problem responsible for a significant number of deaths worldwide, affecting more than 50 million people. In addition, about 5 million cases are diagnosed each year. Specifically, it is estimated that between 4 and 10 out of every 1000 people have active epilepsy, with continuous seizures. In our work, we will focus on CDKL5 deficiency disorder (CDD), a genetic disorder linked to the X chromosome that causes the early onset of severe neurodevelopmental disorders. In many cases it also causes epileptic seizures that are difficult to control. In Spain alone there are 29 diagnosed cases, but it is suspected that there could be close to 400 people, most of them women due to their mode of inheritance and lethality associated with males.

The CDKL5 gene is responsible for the synthesis of a protein necessary for normal brain development and function. Most pathogenic variants of the CDKL5 gene occur spontaneously and involve a non-functional protein or a complete absence of the protein. It has been observed that these dysfunctional variants are not transmitted from parent to offspring and therefore originate de novo. However, there are described cases of siblings affected by the same version of the protein.

In this work, Drosophila melanogaster has been used as a model of the disease in order to simulate and corroborate its symptoms, as well as to understand the genetic and molecular basis of the course of the syndrome. The study has focused on a single candidate gene in flies, CG7236, which is thought to be equivalent to the CDKL gene family in humans and is therefore proposed to be renamed Cdkl. To this end, the experiments carried out were, firstly, crosses with flies that have a CRISPR gene on their second chromosome with flies that have the Cas-9 protein on their third chromosome. Subsequent crosses for germline mutations in the progeny have resulted in a D. melanogaster stock with phenotypic characteristics that differ from control flies of the Canton-S variant, such as seizures or locomotor deficiencies. This was tested in seizure and negative geotaxis assays. Subsequently, genomic DNA extraction from the mutant flies and PCR of the Cdkl fragment revealed the presence of bands of various sizes on an agarose gel, after which it was sequenced.

Thus, this project has used the CRISPR-Cas9 system to generate a CDKL5 deficiency disorder mutant fly that could be the basis for studying the disease in humans and finding successful treatments.