Development of a 3D in Vitro Disease Model for Multiple Myeloma

Abstract

[ES] La ingeniería tisular ha evolucionado hacia el modelado de la fisiología humana in vitro. El microambiente de la médula ósea (BM) es también hogar de procesos malignos. El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia hematológica caracterizada por proliferación y acumulación en la BM de células plasmáticas monoclonales. Los tratamientos han mejorado, sin embargo, sigue siendo incurable. Moléculas de la matriz extracelular como fibronectina (FN) o ácido hialurónico (HA) tienen un papel reconocido en la resistencia a fármacos (DR). La inadecuación de los modelos preclínicos bidimensionales es una de las bases del problema de DR. Se han intentado diferentes enfoques in vitro, sin embargo, se basan en hidrogeles y andamios celulares diseñados para células adherentes, mientras que las células de MM presentan crecimiento en suspensión. El objetivo principal de esta Tesis es desarrollar, optimizar y validar una plataforma de cultivo 3D, denominada microgel, basada en microesferas en un medio líquido y que coexisten con células de MM creciendo dinámicamente en suspensión. Se desarrollaron y caracterizaron diferentes microesferas con diferentes funcionalizaciones. Optimizamos un protocolo de polimerización en suspensión para la obtención de microesferas a base de acrilatos con dos composiciones diferentes (presencia (10%) o ausencia (0%) de ácido acrílico (AA)) i dos distribuciones de tamaño diferentes (< 60 y > 70 ¿m). La FN se adsorbió en la superficie de la microesfera, mientras que el HA, colágeno I y diferentes secuencias peptídicas se injertaron covalentemente. Se modificaron las microesferas comerciales Cytodex 1 para adaptar sus características a la plataforma. Se utilizaron técnicas capa por capa (LbL) para introducir HA y sulfato de condroitina (CS) en su superficie. Por tanto, se ha generado un amplio repertorio de microesferas para desarrollar microgeles. Se optimizaron y validaron las condiciones de cultivo para la plataforma de microgel. Las condiciones óptimas se establecieron como 150 rpm de velocidad de agitación utilizando un agitador orbital y microesferas de < 60 ¿m. Los microgeles con diferentes composiciones y funcionalizaciones permitieron una buena proliferación de las líneas RPMI8226, U226 y MM1.S. Todos los sistemas respetaron el patrón de crecimiento en suspensión, factor que ha demostrado ser clave para su buen desempeño en cultivo 3D. En estudios iniciales de DR, la línea celular RPMI8226 cultivada en microgeles que contenían AA mostró una resistencia significativamente mayor a la dexametasona que sus cultivos en suspensión. Y las líneas RPMI8226, U226 y MM1.S cultivadas en microgeles que contenían AA mostraron una resistencia significativamente mayor a bortezomib que sus cultivos en suspensión. Por lo tanto, la presencia de AA en la matriz polimérica mostró un efecto positivo en la generación de DR in vitro y requerirá más estudios. Se ha validado la reducción de escala del sistema para trabajar con volúmenes más pequeños de microesferas y números reducidos de células, lo que es de gran relevancia para su traslación clínica. Finalmente, se han realizado cultivos preliminares con la línea celular RPMI8226 en los microgeles basados en Cytodex 1. Las microesferas de Cytodex 1 sin modificación tuvieron un efecto negativo sobre la viabilidad de las células de MM. La modificación mediante LbL con los pares quitosano/CS y quitosano/HA aumentó la viabilidad y proliferación. Sin embargo, estos sistemas no respetaron el carácter no adherente de las células MM. Hemos desarrollado y validado un novedoso sistema de cultivo basado en un medio 3D semisólido definido por microesferas y células de MM especialmente diseñado para células en suspensión. Este sistema constituye una herramienta versátil que debe explorarse más a fondo para el cultivo 3D de neoplasias hematológicas y para estudios de resistencia a fármacos in vitro.

[CAT] L'enginyeria tissular ha evolucionat cap al modelat de la fisiologia humana in vitro. El complex microambient de la medul·la òssia (BM) és també llar d'alguns processos malignes. El mieloma múltiple (MM) és una neoplàsia hematològica caracteritzada per una proliferació i acumulació a la BM de cèl·lules plasmàtiques monoclonals. Els tractaments han millorat, no obstant, el MM segueix sent incurable. Molècules de la matriu extracel·lular com fibronectina (FN) o àcid hialurònic (HA) tenen un paper reconegut en la generació de resistència a fàrmacs (DR) en MM. La inadequació dels models preclínics bidimensionals és una de les bases del problema de DR. Per això, s'han intentat diferents aproximacions in vitro, tanmateix es basen en hidrogels i andamis cel·lulars dissenyats per a cèl·lules adherents, mentre que les cèl·lules de MM presenten creixement en suspensió. L'objectiu principal d'aquesta Tesi és desenvolupar, optimitzar i validar una plataforma de cultiu 3D, denominada microgel, basada en microesferes en un medi líquid i que coexisteixen amb cèl·lules de MM que creixen dinàmicament en suspensió. S'han produït i caracteritzat diferents microesferes amb diferents funcionalitzacions. S'ha optimitzat un protocol de polimerització en suspensió per a l'obtenció de microesferes d'acrilats amb dues composicions diferents (presència (10%) o absència (0%) d'àcid acrílic (AA)) i amb dos distribucions de diàmetres diferents (< 60 y > 70 ¿m). La FN es va adsorbir, mentre que el HA, el col·lagen I i diferents seqüències peptídiques es van unir covalentment. S'han modificat microesferes comercials Cytodex 1 per tal d'adaptar les seves característiques a la plataforma del microgel. Mitjançant tècniques capa a capa (LbL) s'han introduït HA i sulfat de condroïtina (CS) a la seua superfície. Per tant, s'ha generat un ampli repertori de microesferes per desenvolupar microgels. Es van optimitzar i validar les condicions de cultiu per a la plataforma de microgel. Les condicions òptimes de cultiu es varen establir com a 150 rpm de velocitat d'agitació utilitzant un agitador orbital i microesferes de < 60 ¿m. Els microgels amb diferents composicions i funcionalitzacions van permetre una bona proliferació de les línies RPMI8226, U226 i MM1.S. Tots els sistemes van respectar el patró de creixement en suspensió, factor que ha demostrat ser clau per al seu bon rendiment en cultius 3D. En estudis inicials de DR línia cel·lular RPMI8226 cultivada en microgels que contenien AA va mostrar una resistència significativament major a la dexametasona que els seus cultius en suspensió convencionals. Línies RPMI8226, U226 y MM1.S cultivades en microgels que contenien AA mostraren una resistència significativament major a bortezomib que els seus cultius en suspensió convencionals. Per tant, la presencia d'AA a la matriu polimèrica de les microesferes va mostrar un efecte positiu en termes de generació de DR in vitro, cosa que requerirà estudis futurs. S'ha validat la reducció de l'escala del sistema per treballar amb volums més petits de microesferes i menys cèl·lules, el que és de gran rellevància per a la seva translació clínica. Finalment, s'han realitzat cultius preliminars amb la línia cel·lular RPMI8226 en els microgels basats en les Cytodex 1. Les microesferes de Cytodex 1 sense modificar van mostrar efecte negatiu sobre la viabilitat de les cèl·lules de MM. La modificació mitjançant LbL amb els parells quitosà/CS i quitosà/HA va augmentar la viabilitat i proliferació de cèl·lules MM. No obstant, aquests sistemes no respectaren el caràcter no adherent de les cèl·lules de MM. S'ha desenvolupat i validat un nou sistema de cultiu cel·lular basat en un medi 3D semisòlid definit per microesferes i cèl·lules de MM, especialment dissenyat per a cèl·lules no adherents. Aquest sistema constitueix una eina versàtil que ha de ser explorada per al cultiu 3D de neoplàsies hematològiques i per a estudis de resistència a fàrmacs in vitro.

[EN] Tissue engineering has evolved towards modeling of human physiology in vitro. The bone marrow (BM) microenvironment is likewise the home of some malignant processes. Multiple myeloma (MM) is a hematological neoplasia characterized by proliferation and BM accumulation of monoclonal plasma cells. Treatments have improved; however, MM remains incurable. Extracellular matrix molecules such as fibronectin (FN) or hyaluronic acid (HA) have a recognized role in drug resistance (DR). The inadequacy of two-dimensional preclinical models is one cause of the DR problem, different in vitro approaches have been developed, however, all these studies are based on hydrogels and scaffolds designed for adherent cells while MM cells are suspension growing cells. The main objective of this Thesis is to develop, optimize and validate a 3D culture platform, termed as microgel, based on microspheres suspended in a liquid media and coexisting with MM cells growing dynamically in suspension. Different microspheres with different functionalities were developed and characterized. We optimized a suspension polymerization protocol for the obtention of acrylates-based microspheres with two different compositions: with presence (10%) or absence (0%) of acrylic acid (AA). We obtained two different size distributions (< 60 and > 70 ¿m). FN was adsorbed on microsphere surface, while HA, collagen I and different peptide sequences were covalently grafted. Commercial Cytodex 1 microspheres were modified to adapt their characteristics to the microgel platform. Layer-by-layer (LbL) technics were used to introduce HA and chondroitin sulfate (CS) on Cytodex 1 surface. Therefore, a wide repertoire of microspheres has been generated to develop microgels. The culture conditions for the microgel platform were optimized and validated. Agitation is needed to keep microspheres and cells in suspension. Optimal culture conditions were 150 rpm of stirring speed using orbital shaker and < 60 ¿m diameter microspheres. Microgels with different compositions (0% AA, 10% AA) and functionalizations (none, HA, FN, collagen 1 and peptide sequences) allowed good proliferation of RPMI8226, U226 and MM1.S cells under 3D conditions. All the 3D systems respected the suspension growth pattern which appears as key factor for their good performance in 3D culture. In the initial DR studies, we found that MM cell line RPMI8226 cultured in microgels containing AA showed significantly higher resistance to dexamethasone than their conventional suspension cultures. And that MM cell lines RPMI8226, U226 and MM1.S cultured in microgels containing AA showed significantly higher resistance to bortezomib than their conventional suspension cultures. Thus, AA in the polymeric microsphere matrix showed a positive effect on the generation of DR in vitro and will require further studies. The scale-down of the system to work with smaller volumes of microspheres and reduced cell numbers has been validated, this is of great relevance for their clinical application. Finally, preliminary cultures with the cell line RPMI8226 have been performed with the Cytodex 1-based microgels. Cytodex 1 microspheres without modification had a negative effect on MM cells viability. LbL modification with the pairs chitosan/CS and chitosan/HA increased MM cells viability and proliferation. However, these systems did not respect the non-adherent character of MM cells. We have developed and validated a novel cell culture system based on a semi-solid 3D media defined by microspheres and MM cells which is specially designed for cells in suspension. It represents a versatile tool that should be further explored for the 3D culture of hematological malignancies and drug resistance studies in vitro.