Generación de nuevos modelos y búsqueda de modificadores para el Síndrome de Dravet en Drosophila Melanogaster

Abstract

[ES] El síndrome de Dravet es una epilepsia severa rara causada por mutaciones en el gen SCN1A, el cual codifica para la proteína Nav1.1, subunidad α de los canales de sodio regulados por voltaje. En esta tesis se ha generado mediante recombinación homóloga, una nueva mutación en el gen para que hemos denominado paraKO, el cual cumple la misma función en Drosophila melanogaster. Estas moscas han mostrado un fenotipo epiléptico inducido por altas temperaturas, y muerte súbita en el caso de las crisis de larga duración. También se han observado alteraciones musculares en ensayos de geotaxis negativa, vuelo y locomoción. Del mismo modo, han presentado problemas cognitivos como la ansiedad y dificultades en el aprendizaje. El uso de imanes como terapia contra el fenotipo epiléptico ha tenido buenos resultados retrasando la aparición de las crisis y disminuyendo su duración y la cantidad de moscas que las padecen. El perfil metabolómico de las cabezas de estas moscas mostró un incremento en la concentración de aminoácidos, succinato y lactato, alteraciones que se pueden relacionar con la epilepsia y la disfunción mitocondrial. El neurotransmisor GABA, principal implicado en el síndrome de Dravet, mostró niveles superiores en el modelo generado. El análisis electrofisiológico de las corrientes de sodio de las motoneuronas aCC en estadío de larva señaló aumentos en las corrientes persistentes de sodio y su ratio con las transitorias, lo cual podría justificar las crisis epilépticas. Además, la excitabilidad y el tamaño de estas células fueron menores. Todos estos cambios presentes en los mutantes KO generados hacen de estas moscas un buen modelo para estudio de la epilepsia en general, y del síndrome de Dravet en particular. Este modelo ofrece nuevas herramientas para entender la patofisiología de la enfermedad y la búsqueda de biomarcadores y tratamientos. Finalmente la búsqueda de modificadores genéticos a través de ensayos de supervivencia, tiempo de recuperación a crisis y vuelo empleando el modelo parabss1 obtuvo buenos resultados con los genes nAchRα4 y KCNQ. El gen toy por el contrario resultó ser intensificador. La variabilidad en los resultados obtenidos en este apartado cuestiona la manera de llevar a cabo este tipo de estudios en modelos animales y pacientes del síndrome de Dravet.

[CA] La síndrome de Dravet és una epilèpsia severa rara causada por mutacions en el gen SCN1A, el qual codifica para la proteïna Nav1.1, subunitat α dels canals de sodi regulats por voltatge. En aquesta tesis s'ha generat, mitjançant recombinació homòloga, una nova mutació en el gen para, anomenada paraKO, el qual té la mateixa funció en Drosophila melanogaster. Aquestes mosques han mostrat un fenotip epilèptic induït por altes temperatures, y mort súbdita en el cas de les crisis de llarga duració. També s'han observat alteracions musculars en assajos de geotaxis negativa, vol y locomoció. De la mateixa manera, han presentat problemes cognitius como l'ansietat i dificultats en l'aprenentatge. L'ús d'imants com teràpia contra el fenotip epilèptic ha tingut bons resultats endarrerint l'aparició de les crisis i disminuint la seua durada i la quantitat de mosques que les pateixen. El perfil metabolòmic dels caps d'aquestes mosques mostrà increments en la concentració d'aminoàcids, succinat i lactat, alteracions les quals es poden relacionar amb l'epilèpsia y la disfunció mitocondrial. El neurotransmissor GABA, principal implicat en la síndrome de Dravet, mostrà nivells superiores en el model generat. L'anàlisi electrofisiològic de las corrents de sodi de les motoneurones aCC en estadi de larva assenyalà augments en les corrents persistents de sodi y el seu ràtio amb las transitòries, lo qual podria justificar las crisis epilèptiques. A més a més, l'excitabilitat y el tamany d'aquestes cèl·lules va ser menor. Todos aquests canvis presents en els mutants KO generats fan d'aquestes mosques un model per a l'estudi de l'epilèpsia en general, i de la síndrome de Dravet en particular. Aquest model ofereix noves ferramentes per a entendre la patofisiología de la malaltia i la recerca de biomarcadors y tractaments. Finalment la recerca de modificadors genètics a través d'assajos de supervivència, temps de recuperació a crisis y vol mitjançant el model parabss1 va obtindre bons resultats amb els gens nAchRα4 y KCNQ. El gen toy pel contrari resultà ser intensificador. La variabilitat en els resultats obtinguts en aquest apartat qüestiona la manera de fer aquest tipus d'estudis en models animals i pacients de la síndrome de Dravet.

[EN] Dravet syndrome is a severe rare epileptic disease caused by mutations in the SCN1A gene coding for the Nav1.1 protein, a voltage-gated sodium channel alpha subunit. In this thesis we have made a new mutation in a gene called paraKO through homologous recombination, the single Drosophila melanogaster gene encoding this type of protein. These flies showed a heat-induced seizing phenotype, and sudden death in long term seizures. In addition to seizures, neuromuscular alterations were observed in climbing, flight and locomotion tests. Moreover, they also manifested some cognitive alterations such as anxiety and difficulties in learning. Using magnets as a therapy for epileptic phenotype, seizures start was delayed, and its duration and the quantity of flies affected was lower. Metabolomic profile of these flies' brains showed an increase in the amount of aminoacids, succinate and lactate, alterations that could be related with epilepsy and mitochondrial dysfunction. GABA, the main neurotransmitter involved in Dravet syndrome, was higher in the paraKO model. Electrophysiological sodium current analysis from aCC motoneurons in larvae stage revealed an increase in persistent currents and their ratio with transients, which is a symptom for epileptic seizures. Cell size and excitability were lower in these cells too. All these changes in the paralytic knock-out flies indicate that this is a good model for epilepsy and specifically for Dravet syndrome. This model could be a new tool to understand the pathophysiology of the disease and to find biomarkers, genetic modifiers and new treatments. Finally, a search for genetic modifiers through survival, recuperation time and flight using parabss1 flies obtained good results with nAchR¿4 y KCNQ. Otherwise, toy gene was an enhancer. However, variability observed in these type of assays dispute how modifiers search is made with model animals and Dravet syndrome patients.