Diseño de hidrogeles de gelatina-PEG con fibronectina y factores de crecimiento como plataforma in vitro de hepatotoxicidad

Abstract

[ES] Los modelos in vitro que se emplean en la detección del efecto de los fármacos en las células hepáticas muestran limitaciones y bajo potencial de predicción. Por ello, actualmente existe una gran necesidad de diseñar nuevos modelos de hepatotoxicidad para ensayos preclínicos que mimeticen máximamente el entorno in vivo de los hepatocitos humanos, con el fin de que éstos mantengan su fenotipo y funcionalidad para conseguir resultados extrapolables a humanos. El desarrollo de la ingeniería tisular ha hecho posible afrontar este problema desde varios enfoques innovadores que permiten cada vez un mayor acercamiento a dichas condiciones fisiológicas. Los hidrogeles inyectables a base de componentes derivados de los presentes en la matriz extracelular (ECM) están en el auge de su uso para la fabricación de estas plataformas debido a sus características mecánicas y fisicoquímicas controlables, pudiendo ajustarlas con mayor precisión a las de la ECM hepática. Además, muestran baja citotoxicidad y ofrecen la posibilidad de incorporar células y biomoléculas (por ejemplo, la fibronectina (FN)) en la solución precursora, dando como resultado una red entrecruzada con células encapsuladas y biomoléculas ancladas. La adición de moléculas como la FN hace posible la presentación del factores de crecimiento (GF) en fase sólida a las células encapsuladas en el hidrogel, aumentando la eficacia de la plataforma para el mantenimiento del fenotipo y de la funcionalidad de los hepatocitos. En el presente Trabajo Final de Grado se realizó la optimización de la síntesis de hidrogeles inyectables híbridos basados en gelatina (Gel) y polietilenglicol (PEG) para su aplicación como plataformas de cultivo in vitro para pruebas de hepatotoxicidad. Se probaron distintos ratios de Gel-PEG y se determinaron sus propiedades mecánicas, así como su capacidad de retención de agua. Se evaluó la viabilidad celular de la línea celular HepG2 para comprobar la biocompatibilidad y como primera puesta a punto del cultivo. Con estos resultados, se seleccionó la composición 1:0.75 como óptima pala continuar los últimos ensayos. En concreto, se evaluó la retención de FN dimérica y monomérica en los hidrogeles, así como la retención del GF de hepatocitos en hidrogeles con y sin FN. De esta manera, se pudo evaluar el efecto de la funcionalización de los hidrogeles con fibronectina. Este trabajo ha permitido la puesta a punto de la plataforma y deja abiertas diversas posibilidades de trabajo para el futuro.

[EN] In vitro models used to detect the effect of drugs on liver cells show limitations and low predictive potential. Therefore, there is currently a great need to design new hepatotoxicity models for preclinical assays that mimic as closely as possible the in vivo environment of human hepatocytes, so that they maintain their phenotype and functionality to achieve results that can be extrapolated to humans. The development of tissue engineering has made it possible to tackle this problem from several innovative approaches that allow an ever-closer approach to these physiological conditions. Injectable hydrogels based on components derived from those present in the ECM are at the forefront of their use for the fabrication of these platforms due to their controllable mechanical and physicochemical characteristics, which can be more closely matched to those of the liver ECM. In addition, they show low cytotoxicity and offer the possibility to incorporate cells and biomolecules (e.g., fibronectin (FN)) into the precursor solution, resulting in a cross-linked network with encapsulated cells and anchored biomolecules. The addition of molecules such as fibronectin enables the presentation of solid-phase growth factors (GF) to the cells encapsulated in the hydrogel, increasing the efficacy of the platform in maintaining the phenotype and functionality of the hepatocytes. In the present Final Degree Project, the optimisation of the synthesis of hybrid injectable hydrogels based on gelatin (Gel) and poly(ethylene) glycol (PEG) for their application as in vitro culture platforms for hepatotoxicity testing was performed. Different Gel-PEG ratios were tested and their mechanical properties as well as their water retention capacity were determined. The cell viability of the HepG2 cell line was evaluated for biocompatibility and as a first culture set-up. Based on these results, the 1:0.75 composition was selected as the optimum for further testing. In particular, the retention of dimeric and monomeric FN in the hydrogels was evaluated, as well as the retention of hepatocyte GF in hydrogels with and without FN. In this way, the effect of functionalisation of the hydrogels with FN could be evaluated. This work has allowed the platform to be fine-tuned and leaves open several possibilities for future work.

[CAT] Els models in vitro que s'empren en la detecció de l'efecte dels fàrmacs en les cèl·lules hepàtiques mostren limitacions i baix potencial de predicció. Per això, actualment existeix una gran necessitat de dissenyar nous models de hepatotoxicitat per a assajos preclínics que mimetitzen màximament l'entorn in vivo dels hepatòcits humans, amb la finalitat que aquests mantinguen el seu fenotip i funcionalitat per a aconseguir resultats extrapolables a humans. El desenvolupament de l'enginyeria tissular ha fet possible afrontar aquest problema des de diversos enfocaments innovadors que permeten cada vegada un major acostament a aquestes condicions fisiològiques. Els hidrogels injectables a base de components derivats dels presents en la matriu extracel·lular (ECM) estan en l'auge del seu ús per a la fabricació d'aquestes plataformes a causa de les seues característiques mecàniques i fisicoquímiques controlables, podent ajustar-les amb major precisió a les de la ECM hepàtica. A més, mostren baixa citotoxicitat i ofereixen la possibilitat d'incorporar cèl·lules i biomolècules (per exemple, la fibronectina (FN)) en la solució precursora, donant com a resultat una xarxa entrecreuada amb cèl·lules encapsulades i biomolècules ancorades. L'addició de molècules com la FN fa possible la presentació del factors de creixement (GF) en fase sòlida a les cèl·lules encapsulades en l'hidrogel, augmentant l'eficàcia de la plataforma per al manteniment del fenotip i de la funcionalitat dels hepatòcits. En el present Treball Final de Grau es va realitzar l'optimització de la síntesi d'hidrogels injectables híbrids basats en gelatina (Gel) i polietilenglicol (PEG) per a la seua aplicació com a plataformes de cultiu in vitro per a proves de hepatotoxicitat. Es van provar diferents ràtios de Gel-PEG i es van determinar les seues propietats mecàniques, així com la seua capacitat de retenció d'aigua. Es va avaluar la viabilitat cel·lular de la línia cel·lular HepG2 per a comprovar la biocompatibilitat i com primera posada a punt del cultiu. Amb aquests resultats, es va seleccionar la composició 1:0.75 com a òptima pala continuar els últims assajos. En concret, es va avaluar la retenció de FN dimèrica i monomèrica en els hidrogels, així com la retenció del GF d'hepatòcits en hidrogels amb i sense FN. D'aquesta manera, es va poder avaluar l'efecte de la funcionalització dels hidrogels amb FN. Aquest treball ha permés la posada a punt de la plataforma i deixa obertes diverses possibilitats de treball per al futur.