Caracterización genotípica y fenotípica de mutantes de receptores de ABA de Nicotiana benthamiana obtenidos por mutagénesis con CRISPR/Cas9

Abstract

[ES] El ácido abscísico (ABA) es la hormona vegetal que regula la transpiración y la apertura estomática bajo estrés por sequía. Por lo tanto, es de vital importancia ahondar en el conocimiento que poseemos sobre el ABA y su vía de señalización asociada para poder mejorar la eficiencia en el uso del agua de las plantas de cosecha de cara a los efectos del cambio climático. La unión del ABA entre los loops gate y latch de los receptores PYR/PYL desencadena la formación del complejo ternario de alta afinidad receptor-ABA-PP2C, que provoca la inactivación de la fosfatasa PP2C y pone en marcha las cascadas de señalización aguas abajo, con respuestas tanto genómicas como no genómicas. En el presente estudio, se llevó a cabo la caracterización genotípica y fenotípica de mutantes de pérdida de función en varios receptores de la familia PYR/PYL de la planta alotetraploide Nicotiana benthamiana. Todas las líneas analizadas tenían cinco mutaciones, localizadas en los genes NbPYL1a, NbPYL1b, NbPYL8a, b y c. De entre ellas, la línea mutante 10K2.7_8/pent3 fue escogida para su caracterización fenotípica. Las semillas de las plantas pent3 mostraron insensibilidad en la germinación y el establecimiento con respecto a N. benthamiana ecotipo silvestre (WT5), usada como control, en presencia de una concentración moderada de ABA. Por otro lado, se midieron otras respuestas a ABA como son la longitud de la raíz, el número de raíces laterales y el peso fresco tanto de la parte radicular como de la parte aérea en ambas líneas en presencia de agonista X, que se une específicamente a receptores de tipo PYL8. Después de 13 días en contacto con el compuesto, la raíz primaria alcanzó una longitud mayor en pent3, mientras que no se observaron diferencias destacables con WT5 en el peso fresco de la parte radicular en conjunto. En cuanto a las raíces laterales, las diferencias entre ambas líneas tampoco fueron significativas; sin embargo, el peso fresco de la parte aérea sí que era mayor en pent3, con unos 12 mg de diferencia con WT5. Estos resultados indican la existencia fenotipos de insensibilidad parcial a ABA y a agonistas de los receptores de ABA en los mutantes péntuples de genes PYR/PYL estudiados, lo cual pone de manifiesto sus alteraciones en la vía de señalización de ABA y refleja un control redundante de los receptores PYR/PYL sobre la vía en Nicotiana benthamiana.

[EN] Abscisic acid (ABA) is the plant hormone which regulates transpiration and stomatal opening under drought stress. Therefore, it is essential to develop a better understanding on ABA and its signalling pathway in order to improve water use efficiency of crop plants, in view of the challenges posed by climate change. Binding of ABA between the gate and latch loops of PYR/PYL receptors triggers the formation of a receptor-ABA-PP2C high-affinity ternary complex, which causes inactivation of PP2C phosphatase activity and unleashes genomic and non-genomic responses. In the present study, a genotypic and phenotypic characterization was carried out on allotetraploid Nicotiana benthamiana PYR/PYL-receptor loss-of-function mutants. All lines analysed contained five mutations, located in NbPYL1a, NbPYL1b, NbPYL8a, b and c genes. Among them, the mutant line 10K2.7_8/pent3 was selected for its phenotypic characterization. The seeds of pent3 plants showed reduced sensitivity in germination and establishment compared to control wild type (WT5) N. benthamiana plants, in the presence of ABA in moderate concentration. On the other hand, other responses to ABA such as primary root length, lateral root number, and fresh weight of root and shoot were measured on both lines in the presence of X agonist, which specifically binds to PYL8-like receptors. After 13 days in contact with the compound, the primary root was longer in pent3, while no remarkable differences with WT5 were observed in root fresh weight as a whole. Regarding lateral roots, the difference between both lines was not significant either; however, shoot fresh weight was about 12 mg higher in pent3 than in WT5. These results indicate the existence of phenotypes of partial insensitivity to ABA and ABA-receptor agonists in the five-PYR/PYL-receptor mutants studied. This highlights alterations in ABA signalling pathway in the mutants and reflects a redundant control of PYR/PYL receptors on the pathway in Nicotiana benthamiana.