Puesta a punto de un sistema de evolución dirigida en plantas mediada por CRISPR.

Abstract

[ES] La posibilidad de generar variantes proteicas artificiales es una estrategia que está revolucionando nuestra capacidad para desarrollar funciones nuevas o mejoradas para muchas aplicaciones en biología y biotecnología. En evolución dirigida, esta diversidad proteica generada artificialmente va ligada a la posterior selección de aquellas proteínas con mejores propiedades. Sin embargo, la mayoría de herramientas de mutagénesis para este propósito han sido desarrolladas hasta ahora para bacterias o levaduras, y no son fácilmente aplicables a plantas. La tecnología CRISPR permite la edición genética en posiciones definidas de un genoma gracias al reconocimiento de una secuencia concreta a través de un RNA guía. En plantas, los sistemas de reparación celulares hacen que esta herramienta haya podido ser utilizada ampliamente para generar inserciones y deleciones nucleotídicas, pero no cambios de base. Herramientas recientes derivadas de esta tecnología CRISPR permiten abordar ahora el reto de la evolución dirigida en plantas. Por ejemplo, la fusión de diferentes deaminasas a la nucleasa Cas9 permiten realizar sustituciones de un nucleótido en posiciones definidas del genoma. De este modo, se abre la puerta a la posibilidad de diseñar proteínas mejoradas y desarrollar plataformas de evolución dirigida, acelerando la mejora de rasgos agronómicos. En este trabajo de Fin de Máster se plantea la puesta a punto de los editores CRISPR de adenina y citidina para la generación de nuevas variantes proteicas en plantas, con el objetivo de estimar la eficiencia de cada sistema y su capacidad real para la generación de plantas mejoradas. Como prueba de concepto, se plantea inicialmente la generación de sustituciones nucleotídicas en genes diana como FT o ETR, ya que la eficiencia de sus guías ha sido previamente comprobada. La eficiencia de cada sistema en la generación de dichas sustituciones será comprobada mediante transformación transitoria en la planta Nicotiana benthamiana y su secuenciación Sanger. Este trabajo sienta las bases para el diseño de una plataforma de evolución dirigida que amplíe el espectro de variantes proteicas generadas y permita, por ejemplo, la obtención de cultivos no transgénicos resistentes a un herbicida al generar mutaciones en la diana proteica del mismo.

[EN] The possibility of generating artificial protein variants is a strategy that is revolutionizing our ability to develop new or improved functions for many applications in biology and biotechnology. In directed evolution, this artificially generated protein diversity is linked to the subsequent selection of those proteins with better properties. However, most mutagenesis tools for this purpose have so far been developed for bacteria or yeast, and are not easily applicable to plants. CRISPR technology allows gene editing at defined positions in a genome thanks to the recognition of a specific sequence through a guide RNA. In plants, cellular repair systems mean that this tool has been widely used to generate nucleotide insertions and deletions, but not base changes. Recent tools derived from this CRISPR technology now allow us to address the challenge of directed evolution in plants. For example, the fusion of different deaminases to the Cas9 nuclease allow substitutions of a nucleotide in defined positions of the genome. In this way, the door is opened to the possibility of designing improved proteins and developing directed evolution platforms, accelerating the improvement of agronomic traits. In this Master's thesis, the development of the CRISPR editors of adenine and cytidine for the generation of new protein variants in plants is proposed, with the aim of estimating the efficiency of each system and its real capacity for the generation of plants. improved. As a proof of concept, the generation of nucleotide substitutions in target genes such as FT or ETR is initially considered, since the efficiency of their guides has been previously verified. The efficiency of each system in the generation of said substitutions will be verified by transient transformation in the Nicotiana benthamiana plant and its Sanger sequencing. This work lays the foundations for the design of a directed evolution platform that broadens the spectrum of protein variants generated and allows, for example, obtaining non-transgenic crops resistant to a herbicide by generating mutations in its protein target.