Estrategias para mitigar la toxicidad asociada a la exposición crónica al mercurio a través de la dieta

Abstract

[ES] La dieta es la principal vía de exposición a mercurio (Hg) para la mayoría de la población. Las principales formas de Hg en los alimentos son el metilmercurio (MeHg) y el Hg inorgánico divalente [Hg(II)]. Aunque el intestino es la principal puerta de entrada del tóxico en la circulación sistémica, los estudios sobre su toxicidad a nivel intestinal son escasos. El objetivo de la presente tesis ha sido evaluar la toxicidad y los mecanismos de acción del Hg(II) y el MeHg a nivel intestinal. Adicionalmente, se ha ensayado la eficacia de cepas de bacterias ácido- lácticas (BAL) como estrategia de reducción de esta toxicidad. Para los estudios in vitro se ha desarrollado un modelo celular en el que se han combinado enterocitos, células mucosecretoras y macrófagos en un sistema bicameral. Las células se han expuesto a Hg(II) y MeHg (0.1-1 mg/L) durante 10 días. Los datos han evidenciado que ambas especies generan un aumento de la respuesta inflamatoria, incrementando la liberación de la citoquina IL-8 e IL-1β, y una respuesta pro-oxidante, con un aumento de las especies reactivas de oxígeno/nitrógeno (ROS/RNS) y una sobreexpresión de proteínas de estrés (HSP70, HSP90 y MT2A). Esta respuesta ha sido más notable en macrófagos, indicando que posiblemente sean las células inmunitarias las que gobiernen la respuesta al tóxico. La situación de estrés va acompañada de una alteración de la expresión de la proteína de las uniones estrechas ZO-1 y una modificación de la morfología de la monocapa. Además, la exposición genera un aumento de la secreción de mucus y una sobreexpresión de su principal mucina, principalmente a MeHg. Los mecanismos de esta hipersecreción podrían estar relacionados con la ruta IL4/IL13/STAT6. Todos estos efectos sobre la monocapa epitelial conllevan un aumento de la permeabilidad y una reducción de la capacidad de regeneración. En los ensayos in vivo se han expuesto ratones BALB/c a Hg(II) y MeHg (1- 10 mg/L) durante 4 meses a través del agua de bebida. Los datos obtenidos han confirmado lo observado in vitro. La exposición a ambas especies (especialmente a 5 y 10 mg/L) induce un proceso inflamatorio en el colon, con un aumento de las citoquinas TNF-α e IL1-β y la presencia de infiltrados de neutrófilos. Paralelamente, la exposición genera estrés oxidativo con un incremento de las ROS/RNS y los peróxidos lipídicos. Se ha confirmado in vivo la participación en esta respuesta de algunas rutas apuntadas in vitro, en concreto p38 MAPK y JNK. Además, también se evidencian alteraciones en la expresión de proteínas de las uniones estrechas y de la mucina MUC2 en el colon, acompañada de una hiperplasia de las células mucosecretoras, especialmente en los tratamientos con MeHg. En estos animales se observa, además, un aumento de la expresión de IL13 e IL4, lo que apunta a la participación de la ruta IL4/IL13/STAT6, tal y como indicaban los ensayos in vitro. Además, estos ensayos in vivo muestran un efecto de ambas especies sobre el metabolismo de la microbiota intestinal con una reducción de los contenidos luminales de los ácidos grasos de cadena corta (SCFA), aunque los cambios detectados en la composición de la microbiota son mínimos. Finalmente, los animales tratados presentan un aumento de la permeabilidad. Todos los datos obtenidos in vitro e in vivo ponen de manifiesto que una exposición continuada a Hg(II) y MeHg genera una disrupción de la barrera intestinal. Los ensayos in vitro realizados para determinar la eficacia de las cepas de BAL de origen murino LE1 y LE2 como estrategia de protección se han realizado coexponiendo el modelo celular a Hg(II) o MeHg (1 mg/L) junto con las cepas durante 7 días. Los datos obtenidos han mostrado un efecto protector de ambas cepas, con una reducción de la respuesta inflamatoria, el estrés y los efectos sobre las uniones estrechas y la producción de mucus. Asimismo, la presencia de ambas bacterias restaura parcialmente la permeabilidad y la capacidad de regeneración de las monocapas. Teniendo en cuenta que en este estudio las BAL están inactivadas térmicamente, esta protección se asocia principalmente a su capacidad de quelación del Hg, aunque no hay que descartar que algún componente estructural de la pared bacteriana pueda ejercer otro tipo de efecto beneficioso. Los ensayos in vivo para confirmar el efecto protector de las BAL se han realizado en ratones BALB/c expuestos durante 2 meses a MeHg (5 mg/L) a través del agua de bebida. Las bacterias, en este caso viables, se han administrado por sonda gástrica diariamente. Los datos obtenidos muestran que, aunque las dos cepas reducen por igual los contenidos colónicos de MeHg, la reducción de los efectos tóxicos es mucho más notable con la cepa LE1. Se observan reducciones de los contenidos de mediadores de inflamación y estrés en el colon, hay una recuperación de la expresión de proteínas constituyentes de las uniones estrechas y del mucus. Se reestablecen los niveles luminales de los metabolitos de la microbiota y se restaura parcialmente la permeabilidad intestinal. Los resultados muestran que, además del proceso de quelación, la cepa LE1 activa la ruta de señalización Nrf2/Keap1/ARE y la producción de la citoquina anti-inflamatoria IL10. Los datos obtenidos in vitro e in vivo, apuntan a que la cepa LE1 podría ser una buena alternativa para reducir la toxicidad intestinal del Hg; reducción que puede tener también repercusiones beneficiosas a nivel sistémico.

[CA] La dieta és la principal via d'exposició a mercuri (Hg) per a la majoria de la població. Les principals formes de Hg en els aliments són el metilmercuri (MeHg) i el Hg inorgànic divalent [Hg(II)]. Encara que l'intestí és la principal porta d'entrada del tòxic a la circulació sistèmica, els estudis sobre la seua toxicitat a nivell intestinal són escassos. L'objectiu de la present tesi ha sigut avaluar la toxicitat i els mecanismes d'acció del Hg(II) i el MeHg a nivell intestinal. Addicionalment, s'ha assajat l'eficàcia de soques de bacteris àcid-làctics (BAL) com a estratègia de reducció d'aquesta toxicitat. Per als estudis in vitro s'ha desenvolupat un model cel·lular en el qual s'han combinat enteròcits, cèl·lules mucosecretores i macròfags en un sistema bicameral. Les cèl·lules s'han exposat des de l'inici a Hg(II) i MeHg (0.1-1 mg/L) durant 10 dies. Les dades han evidenciat que totes dues espècies generen un augment de la resposta inflamatòria, incrementant l'alliberament de la citocina IL- 8 i IL-1β, i una resposta pro-oxidant, amb un augment de les espècies reactives d'oxigen/nitrogen (ROS/RNS) i una sobreexpressió de proteïnes d’estrès (HSP70, HSP90 i MT2A). Aquesta resposta ha sigut més notable en macròfags, indicant que possiblement són les cèl·lules immunitàries les que governen la resposta al tòxic. La situació d’estrès va acompanyada d'una alteració de l'expressió de la proteïna de les unions estretes ZO-1 i una modificació de la morfologia de la monocapa. A més, l'exposició, principalment a MeHg, genera un augment de la secreció de mucus i una sobreexpressió de la seua principal mucina. Els mecanismes d'aquesta hipersecreció podrien estar relacionats amb la ruta IL4/IL13/STAT6. Tots aquests efectes sobre la monocapa epitelial comporten un augment de la permeabilitat i una reducció de la capacitat de regeneració. En els assajos in vivo s'han exposat ratolins BALB/c a Hg(II) i MeHg (1-10 mg/L) durant 4 mesos a través de l'aigua de beguda. Les dades obtingudes han confirmat l'observat in vitro. L'exposició a totes dues espècies (especialment a 5 i 10 mg/L) indueix un procés inflamatori en el còlon, amb un augment de les citocines TNF-α i IL1-β i la presència d'infiltrats de neutròfils. Paral·lelament, l'exposició genera estrès oxidatiu amb un increment de les ROS/RNS i els peròxids lipídics. S'ha confirmat in vivo la participació en aquesta resposta d'algunes rutes apuntades in vitro, en concret p38 MAPK i JNK. A més, també s'evidencien alteracions en l'expressió de proteïnes de les unions i de la mucina MUC2 en el còlon, acompanyada d'una hiperplàsia de les cèl·lules mucosecretores, especialment en els tractaments amb MeHg. En aquests animals hi ha, a més, un augment de l'expressió d'IL13 i IL4, la qual cosa apunta a la participació de la ruta IL4/IL13/STAT6, tal com indicaven els assajos in vitro. A més, aquests assajos in vivo mostren un efecte de les espècies de Hg sobre el metabolisme de la microbiota intestinal, amb una reducció dels continguts luminals dels àcids grassos de cadena curta (SCFA), encara que els canvis en la composició de microbiota intestinal son minims. Finalment, els animals tractats presenten un augment de la permeabilitat. Totes les dades obtingudes in vitro i in vivo posen de manifest que una exposició continuada a Hg(II) i MeHg genera una disrupció de la barrera intestinal. Els assajos in vitro realitzats per a determinar l'eficàcia de les soques de BAL d'origen murí LE1 i LE2 com a estratègia de protecció s'han realitzat coexposant el model cel·lular combinat a Hg(II) o MeHg (1 mg/L) juntament amb les soques durant 7 dies. Les dades obtingudes han mostrat un efecte protector de totes dues soques, amb una reducció de la resposta inflamatòria, l'estrès i els efectes sobre les unions estretes i la producció de mucus. Així mateix, la presència dels bacteris restaura parcialment la permeabilitat i la capacitat de regeneració de les monocapes. Tenint en compte que en aquest estudi les BAL estan inactivades tèrmicament, aquesta protecció s'associa principalment a la seua capacitat de quelació del Hg, encara que no cal descartar que algun component estructural de la paret bacteriana puga exercir un altre tipus d'efecte beneficiós. Els assajos in vivo per a confirmar l'efecte protector de les BAL s'han realitzat en ratolins BALB/c exposats durant 2 mesos a MeHg (5 mg/L) a través de l'aigua de beguda. Els bacteris, en aquest cas viables, s'han administrat per sonda gàstrica diàriament. Les dades obtingudes en aquest assaig mostren que, encara que els dues soques redueixen per igual els continguts colònics de MeHg, la reducció dels efectes tòxics és molt més notable amb la soca LE1. S'observen reduccions dels continguts dels mediadors d'inflamació i estrès en el còlon, hi ha una recuperació de l'expressió de proteïnes constituents de les unions estretes i el mucus. Es restableixen els nivells luminals dels metabòlits de la microbiota i es restaura parcialment la permeabilitat intestinal. Els resultats mostren que a més del procés de quelació, la soca LE1 activa la ruta de senyalització Nrf2/Keap1/ARE i la producció de la citocina anti-inflamatòria IL10. Les dades obtingudes in vitro i in vivo apunten al fet que la soca LE1 podria ser una bona alternativa per a reduir la toxicitat intestinal del Hg; reducció que pot tindre també repercussions beneficioses a nivell sistèmic.

[EN] A cell model for in vitro studies in which enterocytes, mucosecretory cells and macrophages have been combined in a bicameral system has been developed. Cells have been exposed to Hg for 10 days. The data have shown that both species induce an inflammatory response and a pro-oxidant response, with an increase in reactive oxygen/nitrogen species and an overexpression of stress proteins. The situation of stress is accompanied by alterations in the expression of the tight junction protein ZO-1 and changes in the morphology of the intestinal monolayer. In addition, exposure, especially to MeHg, generates an increase in mucus secretion and an overexpression of its main mucin. The mechanisms of this hypersecretion could be related to the IL4/IL13/STAT6 pathway. All these effects on the epithelial monolayer lead to and increased permeability and a reduced regeneration capacity. In vivo assays have been performed in BALB/c mice exposed to Hg (1-10 mg/L) for 4 months through drinking water. The data obtained have confirmed the previous results observed in vitro. Exposure to both species induces an inflammatory process in the colon and generates oxidative stress with an increase in ROS/RNS and lipid peroxides. The participation in this response of some signaling pathways targeted in vitro has been confirmed in vivo. In addition, alterations in the expression of tight junction proteins and the mucin MUC2 in the colon are also evidenced, accompanied by a hyperplasia of the mucosecretory cells, especially in MeHg treatments. In these animals, there is also an increase in the expression of IL-13 and IL-4 cytokines, which points to the participation of the IL4/IL13/STAT6 pathway. In addition, these in vivo assays show an effect of both species on the metabolism of the intestinal microbiota, with a reduction in the luminal contents of short-chain fatty acids, although changes in the intestinal microbiota composition are minimal. Finally, the treated animals showed an increase in permeability. The in vitro studies carried out to determine the efficacy of the BAL strains of murine origin LE1 and LE2 as a strategy of protection have been performed by co-exposing the combined cell model to Hg (1 mg/L) together with the strains for 7 days. The data obtained have shown a protective effect of both strains, with a reduction in the inflammatory response, oxidative stress and the effects on tight junctions and mucus production. In the same way, the presence of both bacteria partially restores the permeability and the regenerative capacity of the monolayers. Bearing in mind that in this study the LABs are heat-inactivated, this protection is mainly associated with their ability to bind Hg, although it cannot be ruled out that some structural components of the bacterial wall may exert another type of beneficial effect. In vivo assays carry out to confirm the protective effect of LAB have been performed in BALB/c mice exposed for 2 months to MeHg (5 mg/L) through drinking water. The strains of LAB have been administered daily by gavage. Data show that, the reduction of the toxic effects is much more pronounced when LE1 strain is administrated. Reductions in the contents of inflammatory and stress mediators in the colon are observed, together with a recovery in the expression of proteins of the tight junctions and the mucus layer. The luminal levels of microbiota metabolites are restored, and intestinal permeability is partially reestablished. The results show that in addition to the chelation process, LE1 strain activates the Nrf2/Keap1/ARE signaling pathway and the production of the anti-inflammatory cytokine IL10. The data obtained in vitro and in vivo suggest that LE1 strain could be a good strategy to reduce Hg intestinal toxicity; reduction that can also have beneficial repercussions at a systemic level.