Assessment of Citrus Reproductive Biology for Seedless Mandarin Production and its Interaction with Temperature

Abstract

[ES] Desde el origen de los cítricos, hibridaciones naturales ancestrales, espontáneas o de cultivo a lo largo de miles de años, han ocasionado fenómenos de mezcla que han determinado la complejidad de la biología reproductiva de los cítricos cultivados hoy en día. El objetivo global de esta tesis doctoral es aumentar el conocimiento sobre diferentes aspectos reproductivos que son cruciales para la mejora y propagación de los cítricos y su interacción con las condiciones ambientales. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido el análisis del efecto de la temperatura en la fase progámica de los cítricos. Hemos comprobado que las temperaturas altas redujeron el tiempo que necesitaban los tubos polínicos para llegar a los óvulos y también aceleraron la degeneración del pistilo, mientras que las bajas temperaturas produjeron los efectos opuestos. Sin embargo, los tubos polínicos pudieron llegar a los óvulos en todos los cruces estudiados. Es interesante señalar que observamos por primera vez en cítricos tanto la germinación del polen como el crecimiento del tubo polínico a 10ºC. Las mandarinas representan el 24% de la producción total de cítricos y la ausencia de semillas se valora como criterio de calidad en el mercado de la fruta fresca. La aptitud partenocárpica (AP) es la clave para la producción de frutos sin semillas cuando se combina con la autoincompatibilidad (AI) o la esterilidad. El segundo objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar AP y AI para variedades de mandarina con características relevantes como progenitores para la mejora genética de mandarinas sin semillas. Para ello, desarrollamos un protocolo eficiente basado en la emasculación, la autopolinización manual y la polinización cruzada manual. Se observaron seis comportamientos diferentes entre las nueve variedades analizadas. Subrayar que más allá de la importancia crítica de la AI para la producción de frutos sin semillas, la AI es un obstáculo para los programas de mejora genética basados en hibridación, ya que reduce las posibilidades de cruzamiento. Esta circunstancia motivó el planteamiento del tercer objetivo de esta tesis doctoral. Dicho objetivo fue comparar la eficiencia de la ruptura de la reacción de AI por tres factores previamente identificados en otras especies: estrés por temperatura, polinización de yemas florales y poliploidización. Los tres métodos tuvieron éxito en la obtención de plantas autofecundadas, y la polinización de yemas florales resultó ser el método más eficiente. La selección asistida por marcadores (MAS) permite la selección de genotipos en la etapa de plántula, lo que la convierte en una herramienta poderosa, especialmente en especies de árboles con un largo período juvenil, como es el caso de los cítricos. El cuarto objetivo de esta tesis doctoral se centró por tanto en el desarrollo de marcadores SNPs asociados a poliembrionía y esterilidad masculina. Mediante estudios exhaustivos de asociación genética, identificamos una región genómica en el grupo de ligamiento 1 asociado con poliembrionía y una región genómica en el grupo de ligamiento 8 asociado con NPG. Se desarrollaron marcadores SNP cercanos a genes que tienen funciones relacionadas con la esterilidad masculina y con la poliembrionia para las dos regiones genómicas. Esta tesis doctoral proporciona nuevos conocimientos sobre la biología reproductiva de los cítricos y la influencia de la temperatura en ella. El conocimiento generado permitirá implementar de manera más eficiente los programas de mejora genética, particularmente aquellos destinados a la obtención de variedades sin semillas. Además, este conocimiento podrá utilizarse para ayudar en la respuesta a algunos de los desafíos más apremiantes que plantea el escenario actual de calentamiento global.

[CA] Des de que es van originar els cítrics, hibridacions naturals ancestrals, espontànies o de conreu, al llarg de milers d'anys, han ocasionat fenòmens de mescla que han determinat la complexitat de la biologia reproductiva dels cítrics actualment conreats. L'objectiu global d'aquesta tesi va ser augmentar el coneixement de diferents aspectes reproductius dels cítrics ¿especialment en la seua interacció amb les condicions ambientals¿ crucials per a la seua millora genética i reproducció, El nostre primer objectiu ha estat l'anàlisi de l'efecte de la temperatura en la fase progàmica dels cítrics. Hem comprovat que les temperatures càlides redueixen el temps necessari per arribar als òvuls pels tubs de pol·len i que també acceleren la degeneració del pistil; mentre les temperatures fredes van produeixen els efectes contraris. No obstant això, els tubs pol·línics van poder arribar als òvuls en totes les creus estudiades. Curiosament, vam observar per primera vegada als cítrics tant la germinació del pol·len com el creixement del tub pol·línic a 10ºC. Les mandarins representen el 24% de la producció total de cítrics i l'absència de llavors és un criteri de qualitat crucial en el mercat de la fruita fresca. La capacitat partenocàrpica (PA) és la clau per a la producció de fruites sense llavors quan s'acobla a l'autoincompatibilitat (SI) o l'esterilitat. El segon objectiu d'aquesta tesi doctoral va ser avaluar PA i SI per a varietats de mandarines amb característiques rellevants com a progenitors per a la millora genètica de mandarines sense llavors. Amb aquesta finalitat, hem desenvolupat un protocol eficient basat en l'emasculació, l'autopol·linització manual i la pol·linització creuada manual. Es van observar sis comportaments diferents entre les nou varietats analitzades. Subratllar que, enllà de la importància crítica del SI en la producció de fruites sense llavors, el SI és alhora un obstacle per als programes de millora basats en la hibridació, ja que redueix les possibilitats d'encreuament. Aquesta circumstància va motivar el plantejament del tercer objectiu d'aquesta tesi doctoral. Aquest objectiu va ser comparar l'eficiència de la ruptura de la reacció SI per tres factors identificats prèviament en altres espècies: estrès per temperatura, pol·linització de rovells florals i poliploidització. Els tres mètodes van tenir èxit en l'obtenció de plantes autofecundades, i la pol·linització de rovells florals va resultar ser el mètode més eficient. La selecció assistida per marcadors (MAS) en l'etapa de plàntules permet la selecció de genotips diana, la qual cosa la converteix en una eina potent, especialment en espècies d'arbres amb període juvenil llarg, com els cítrics. El quart objectiu d'aquesta tesi doctoral se centra en el desenvolupament de marcadors SNPs associats a la poliembriona i l'esterilitat masculina. Estudis exhaustius d'associació genètica, vam identificar una regió genòmica al grup de lligament 1 associada a la poliembrionia i una regió genòmica al grup de lligament 8 associada amb NPG. Es van desenvolupar marcadors SNP estretament relacionats amb gens implicats per a les dues regions genòmiques. Aquesta tesi doctoral proporciona nous coneixements sobre la biologia reproductiva dels cítrics i la influència de la temperatura sobre ella. El coneixement generat permetrà implementar de manera més eficient els programes de millora genètica, especialment aquells destinats a l'obtenció de varietats sense llavors. A més, aquest coneixement es podrà utilitzar en la complexa resposta a alguns dels reptes més urgents que planteja l'escenari actual d'escalfament global.

[EN] Since the origin of citrus, ancestral natural hybridizations, thousands of years of cultivation and admixture phenomenon have resulted in the complexity of the reproductive biology of today's cultivated citrus. The global objective of this PhD was to increase our knowledge on different reproductive aspects that are crucial for citrus breeding and propagation and their interaction with environmental conditions. Temperature in the progamic phase is critical for the success of plant sexual reproduction. Pollen grain germination, stigmatic receptivity and pollen tube growth are the main components of this phase. The analysis of temperature effect on the progamic phase of citrus was our first objective. Using three compatible crosses within the Citrus genus, we evaluated, with this method, the effect of four temperature regimes in every process during the progamic phase. Warm temperatures reduced the time needed by pollen tubes to reach the ovules and also accelerate pistil degeneration while cold temperatures produced the opposite effects. However, pollen tubes were able to reach the ovules in all crosses studied. Interestingly, we observed for the first time in citrus both pollen germination and pollen tube growth at 10ºC. Mandarins account for 24% of total citrus production and seedlessness is a crucial quality criterion for the mandarin fresh fruit market. Parthenocarpic ability (PA) is the key for seedless fruit production when it is coupled with self-incompatibility (SI) or sterility. The second objective of this PhD dissertation was to evaluate PA and SI for mandarin varieties with relevant characteristics as parents for seedless mandarin breeding. For this purpose, we developed an efficient protocol based on emasculation, hand self-pollination and hand cross-pollination. Pollen performance was analysed by histological observations, together with fruit set and seed production. Six different behaviors were observed among the nine varieties analysed. Beyond the critical importance of SI for seedless fruit production, SI is an obstacle for breeding programs based on hybridization as it reduces crossing possibilities. The third objective of this PhD dissertation was to compare the efficiency of the SI reaction breakdown by three factors previously identified in other plant species: temperature stress, bud pollination and polyploidization. The three methods were successful in recovering selfed plants, and bud pollination was the most efficient approach. Chromosome doubling was also efficient, but involved developing tetraploid plants. Cold temperature stress allowed us to obtain a few diploid selfed plants. However, this method proved much more complex to apply than bud pollination in specific breeding programs. Marker-assisted selection (MAS) allows the selection of target genotypes at the seedling stage, making it a powerful tool, especially in tree species with long juvenile period, such as citrus. The 4th objective of this PhD dissertation focuses on the development of SNPs markers associated with polyembryony and male sterility. Through genetic association studies, we identified a genomic region in linkage group 1 associated with polyembryony and a genomic region on linkage group 8 associated with NPGA. SNP markers closely linked with implied genes were developed for the two genomic regions. Overall, this PhD dissertation provides new insights into citrus reproductive biology and the influence of temperature on it. The knowledge generated will allow to implement breeding programs more efficiently, particularly those aimed at obtaining seedless varieties. This knowledge can eventually be used to respond to some of the most pressing challenges posed by the current global warming scenario.