Development of Analytical Procedures for the Characterization of Polypeptide-Based Nanoconjugates

Abstract

[ES] Debido a la naturaleza (poli)iónica de los conjugados polipéptido-fármaco (PDC), su traslado a clínica puede ser una tarea complicada y costosa, que requiere técnicas de polimerización reproducibles y escalables, la implementación de herramientas analíticas sofisticadas, pasos de caracterización exhaustivos y la recopilación de datos detallados de seguridad y eficacia. Algunas técnicas clásicas implementadas en el control de calidad de los PDC no se pueden utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de productos de degradación y metabolitos. Como alternativa, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) se han posicionado de forma relevante en dicha caracterización de polipéptidos y PDC. Mediante el uso de métodos de LC-MS, se puede realizar el análisis tanto de fármacos como de productos o metabolitos de degradación. Además, dado que la separación en AF4 no se basa en la interacción del analito con la columna, como ocurre en SEC, sino aplicando el flujo cruzado en un canal vacío; en AF4 es posible una separación de moléculas "a medida" según su tamaño y peso molecular dando lugar a la mejora selectiva de la separación. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente con respecto al diseño de PDC y su caracterización, la investigación incluida en esta tesis se centra en el desarrollo de nuevos procedimientos analíticos que ayuden a la selección de candidatos PDC con las características adecuadas que les permitirán avanzar a su evaluación preclínica. Implementaremos una herramienta de inteligencia artificial, diseño de experimentos, para desarrollar métodos analíticos adecuados y determinar las condiciones óptimas en la síntesis de nanoconjugados polipeptídicos. Además, exploraremos técnicas relativamente nuevas, como AF4 para desarrollar nuevos nanoconjugados polipeptídicos simples y de combinación y además, generaremos imágenes de espectrometría de masas, para entender su comportamiento en modelos preclínicos relevantes, lo que nos permitirá identificar terapias eficaces para una gran variedad de patologías (tumores sólidos avanzados incluyendo cáncer de mama triple negativo, cáncer de próstata y cáncer de páncreas, así como, lesión medular).

[CAT] A causa de la naturalesa (poli)iònica i, de vegades, proteica dels conjugats polipèptid-fàrmac (PDC), el seu trasllat a clínica pot ser una tasca complicada i costosa, que requereix tècniques de polimerització reproduïbles i escalables, la implementació d'eines analítiques sofisticades, passos de caracterització exhaustius i la recopilació de dades detallades de seguretat i eficàcia. Algunes tècniques clàssiques implementades en el control de qualitat dels PDC no es poden utilitzar per l'anàlisi qualitativa i quantitativa de productes de degradació i metabòlits. Com a alternativa, l'espectrometria de masses (MS) i l'anàlisi del fraccionament de flux de camp de flux asimètric (AF4) han trobat el seu camí en la caracterització de PDC. Mitjançant l'ús de mètodes LC-MS, es pot realitzar l'anàlisi tant de fàrmacs com de productes/metabòlits de degradació. A més, atès que la separació en AF4 no es basa en la interacció de l'analit amb la columna com en SEC sinó aplicant el flux creuat en un canal buit, una separació de molècules "a mesura" segons la seua grandària i pes molecular i la millora selectiva de la separació és possible en l'instrument AF4. Tenint en compte tot el descrit anteriorment respecte al disseny de PDC i la seua caracterització, la investigació inclosa en aquest projecte es centra en el desenvolupament de nous procediments analítics que ajuden a la selecció de candidats PDC per als seu estudi preclínic posterior. Implementarem una eina d'intel·ligència artificial, disseny d'experiments, per a desenvolupar mètodes analítics i la síntesi de nanoconjugats basats en polipèptids de manera adequada. A més, explorarem tècniques relativament noves, com AF4, i generarem imatges d'espectrometria de masses, per a desenvolupar nous conjugats a la recerca de teràpies eficaces per a tractar una varietat de malalties (càncer de mama triple negatiu, càncer de pròstata, càncer de pàncrees, així com en la lesió de medul·la espinal).

[EN] Due to the (poly)ionic and proteinic nature of polypeptide-drug conjugates (PDCs), their translation "from bench to bedside" represents a complex and expensive undertaking, requiring reproducible and scalable polymerization techniques, the implementation of sophisticated analytical tools, exhaustive characterization steps, and the collection of detailed safety and efficacy data. Classical techniques, such as liquid chromatography (LC) - UV/Vis and size exclusion chromatography (SEC) implemented in the quality control of PDCs during and after synthesis, cannot always support a qualitative and quantitative analysis of degradation products and metabolites. As an alternative, mass spectrometry (MS) and asymmetric flow field flow fractionation (AF4) have grown in influence on polypeptide and PDC characterization. The analysis of drug and degradation products/metabolites can take advantage of LC when coupled to MS. Meanwhile, AF4-mediated separation does not suffer from problems related to the interaction of the analyte with the column like in SEC; instead, AF4 applies a cross flow in an empty channel, which supports the "tailor-made" separation of molecules according to size and molecular weight. The research included in this Ph.D. thesis focuses on developing new analytical procedures that will aid the selection of PDC candidates for further preclinical studies. We implemented an artificial intelligence tool (design of experiments) to develop analytical methods and optimize the synthesis of genipin-crosslinked PDCs. Moreover, we explored relatively new techniques, such as AF4 and mass spectrometry imaging, in developing novel single and combination PDCs and studying their biological fate in the search for efficient therapies for a range of diseases (advanced solid tumors, including triple negative breast, prostate, and pancreatic cancer, as well as spinal cord injury).