Role of Cyclooxygenase-2 in Ischemia-Reperfusion Injury in the Liver

Abstract

[ES] La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) hepática (IRI) es una causa importante de mortalidad y morbilidad en la resección hepática y el trasplante de hígado. Durante la hipoxia, el hígado permanece sin oxígeno, cambiando su metabolismo y parando la síntesis de ATP. Paradójicamente, el restablecimiento del flujo de oxígeno causa más daño, activando el sistema inmunitario que generará una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) causando daño celular y tisular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una enzima clave en la biosíntesis de prostaglandinas y su importancia en la IRI es controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, es el principal producto de la COX-2, y participa en la mediación de procesos patológicos como la inflamación, la fiebre y el dolor. El uso de AINEs, inhibidores específicos de la COX, apunta a un efecto beneficioso en la resolución del proceso inflamatorio, pero cada vez más estudios apoyan el papel antiinflamatorio de la COX-2. De hecho, estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de COX-2 en hepatocitos protege a los ratones de la apoptosis y el estrés celular, además de reducir la respuesta inflamatoria en diferentes modelos de enfermedad hepática. En esta tesis doctoral, se utilizó un ratón transgénico que sobreexpresa COX-2 en los hepatocitos (h-COX-2 Tg) para dilucidar el papel y la implicación de la COX-2 en la IRI. Los animales de tipo silvestre (Wt) y h-COX-2 Tg fueron sometidos a 90 min de isquemia, seguidos de 4 o 24 h de reperfusión. Comparando los animales h-COX-2 Tg con sus hermanos Wt, el daño celular y tisular se atenúa tras la IRI. Entre las distintas vías modificadas, la cascada inflamatoria está menos activada, con menor liberación de citoquinas pro-inflamatorias, menor reclutamiento hepático, e infiltración de neutrófilos. Las vías de necrosis y apoptosis también se atenúan así como se reduce del estrés del retículo endoplásmico, y aumenta la autofagia. La respuesta antioxidante se potencia en el contexto de la sobreexpresión de COX-2 y la producción total de ROS es menor, lo que contribuye a un menor daño tisular. Cuando los animales Wt se someten un pre-condicionamiento (PC), la COX-2 endógena se induce a niveles más altos que sin PC, mostrando menos daño, una inflamación atenuada, y una respuesta antioxidante mejorada. Además, se muestra que el papel de la COX-2 en esta protección es específico, ya que su inhibición con DFU revierte los efectos observados e iguala el daño causado a los animales Wt. Las mitocondrias son actores centrales en la fisiopatología de la IRI. En este sentido, la función mitocondrial está preservada en los hígados que sobreexpresan COX-2, con un potencial de membrana mitocondrial conservado y una tasa respiratoria preservada. Estos efectos pueden explicarse por una estabilización de las crestas mitocondriales, invaginaciones de la membrana mitocondrial interna (IMM) que se mantienen mediante interacciones de varias isoformas de la proteína OPA1. Su procesamiento está mediado por proteasas, como OMA1. En ratones h-COX-2 Tg hay un menor procesamiento de OPA1, que se correlaciona con una actividad atenuada de OMA1. Por otro lado, se realizó un estudio retrospectivo en pacientes que habían sido sometidos a un trasplante hepático. Se analizaron los niveles de PGE2 y se correlacionaron con las funciones hepáticas tras el trasplante. Este análisis muestra que la presencia de PGE2 en el plasma de los pacientes receptores se correlaciona con un mejor pronóstico, mientras que unos niveles más bajos de PGE2 se asocian con una disfunción precoz del injerto. Todos estos resultados presentan a la COX-2 como un nuevo actor en la protección del hígado tras I/R, mostrando un papel antiinflamatorio y antioxidante, así como reduciendo el daño mitocondrial, el estrés celular y la muerte celular. Además, se demuestra cómo las prostaglandinas derivadas de la COX-2 en condiciones fisiológicas pueden desempeñar un papel protector en casos de trasplante hepático.

[CA] La lesió per isquèmia-reperfusió (I/R) hepàtica (IRI) és una causa important de mortalitat i morbiditat en la resecció hepàtica i el trasplantament de fetge. Durant la hipòxia, el fetge roman sense oxigen, canviant el seu metabolisme i aturant la síntesi d'ATP. Paradoxalment, el restabliment del flux d'oxigen causa més danys, activant el sistema immunitari que genera una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS) causant dany cel·lular i tissular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) és un enzim clau en la biosíntesi de prostaglandines i la seva importància a l'IRI és controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, és el principal producte de la COX-2, i participa en la mediació de processos patològics com la inflamació i la febre. Mentre que l'ús d'AINEs, inhibidors específics de la COX-2, apunta a un efecte beneficiós en la resolució del procés inflamatori, cada cop més estudis donen suport a un paper antiinflamatori de la COX-2. De fet, estudis previs han demostrat que la sobreexpressió de COX-2 en hepatòcits protegeix els ratolins de l'apoptosi i l'estrès cel·lular, a més de reduir la resposta inflamatòria, en diferents models de malaltia hepàtica. En aquesta tesi, s'ha utilitzat un ratolí transgènic que sobreexpressa la COX-2 en els hepatòcits (h-COX-2 Tg) per dilucidar el paper i la implicació de la COX-2 a l'IRI. Els animals de tipus silvestre (Wt) i h-COX-2 Tg van ser sotmesos a 90 min d'isquèmia, seguits de 4 o 24 h de reperfusió. Comparant els animals h-COX-2 Tg amb els seus germans Wt, el dany cel·lular i tissular s'atenua després de l'IRI. Entre les diferents vies modificades, la cascada inflamatòria està menys activada, s'alliberen menys citocines proinflamatòries , hi ha un menor reclutament hepàtic i menor infiltració de neutròfils. Les vies de necrosi i apoptosi també s'atenuen, així com es redueix l'estrès del reticle endoplasmàtic, i l'autofàgia augmenta. La resposta antioxidant es potencia i la producció total de ROS també és menor, fet que contribueix a un menor dany tissular. Quan els animals Wt se sotmeten a un precondicionament (PC), la COX-2 endògena s'indueix a nivells més alts que sense PC, i aquests fetges mostren menys dany, una inflamació atenuada i una resposta antioxidant millorada. A més, es mostra que el paper de la COX-2 en aquesta protecció és específic, ja que la seva inhibició amb DFU, reverteix els efectes observats i iguala el dany causat als animals Wt. Els mitocondris són actors centrals en la fisiopatologia de l'IRI. En aquest sentit, la funció mitocondrial és preservada als fetges que sobreexpressen COX-2, com es pot demostrar per un potencial de membrana mitocondrial conservat i una taxa respiratòria preservada. Aquests efectes es poden explicar per una estabilització de les crestes mitocondrials, invaginacions de la membrana mitocondrial interna (IMM) que es mantenen mitjançant interaccions de diverses isoformes d'OPA1, una proteïna de la IMM. El seu processament està mediat per proteasas, com OMA1. En ratolins h-COX-2 Tg hi ha un menor processament d'OPA1, que es correlaciona amb una activitat atenuada d'OMA1, mostrant una estabilització de les crestes. D'altra banda, es va fer un estudi retrospectiu amb pacients que havien estat sotmesos a un trasplantament hepàtic. Es van analitzar els nivells de PGE2 i es van correlacionar amb les funcions hepàtiques després del trasplantament. Aquesta anàlisi mostra que la presència de PGE2 en el plasma dels pacients receptors es correlaciona amb un millor pronòstic, mentre que uns nivells més baixos de PGE2 s'associen amb una disfunció precoç de l'empelt. Tots aquests resultats presenten a la COX-2 com un nou actor en la protecció del fetge després d'I/R, mostrant un paper antiinflamatori i antioxidant, així com reduint la lesió mitocondrial, l'estrès cel·lular i la mort cel·lular. A més, es demostra com les prostaglandines derivades de la COX-2 en condicions fisiològiques poden exercir un paper protector en casos de trasplantament hepàtic.

[EN] Hepatic ischemia-reperfusion (I/R) injury (IRI) is a major cause of mortality and morbidity in liver resection and liver transplantation. During the hypoxia, the liver remains without oxygen supply, shifting its metabolism and stopping the ATP synthesis. Paradoxically, the restoration of oxygen flow causes the most damage with an activation of the immune system that will generate a burst of reactive species of oxygen (ROS) that will cause cell and tissue damage. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a key enzyme in prostaglandin biosynthesis and its importance in IRI is controversial. PGE2, prostaglandin E2, is the main product of COX-2, and is mainly involved in mediating pathological processes such as inflammation, fever and pain. While the use of NSAIDs, specific COX inhibitors, points to a beneficial effect in the resolution of the inflammatory process, several studies support the idea of an anti-inflammatory role of COX-2. In fact, previous studies have shown that COX-2 overexpression in hepatocytes protects mice from apoptosis and cellular stress, as well as reducing the inflammatory response, in different liver disease models. In this PhD thesis, a hepatocyte-specific COX-2 transgenic mouse (h-COX-2 Tg) was used to elucidate the role and involvement of COX-2 in IRI. Wild type (Wt) and h-COX-2 Tg animals were subjected to 90 min of ischemia, followed by 4 or 24 h of reperfusion. Comparing h-COX-2 Tg animals with their Wt littermates, cellular and tissue damage resulting from IRI is attenuated. Among these pathways, the inflammatory cascade is less activated, with less pro-inflammatory cytokine release, less hepatic recruitment and neutrophil infiltration. Necrosis and apoptosis pathways are also attenuated such as reduced endoplasmic reticulum stress, and increased autophagy. The antioxidant response appears to be enhanced in the context of COX-2 overexpression and total ROS production is also lower, contributing to less tissue damage. When Wt animals are subjected to preconditioning (PC), endogenous COX-2 is induced at higher levels than without PC, and these livers show less damage, attenuated inflammation, and an enhanced antioxidant response. Furthermore, the role of COX-2 in this observed protection has been shown to be specific, as its inhibition with DFU, reverses the observed effects, and matched the damage caused to Wt animals. Mitochondria are central players in the pathophysiology of IRI. In this regard, mitochondrial function is preserved in COX-2-overexpressing livers, as can be demonstrated by a conserved mitochondrial membrane potential and a preserved respiratory rate. These results can be explained by a stabilisation of mitochondrial cristae, invaginations of the inner mitochondrial membrane (IMM) that maintained through interactions of various isoforms of OPA1. Its processing is mediated by proteases, such as OMA1, which acts under certain stimuli. In h-COX-2 Tg mice, there is a reduced OPA1 processing that correlates with attenuated OMA1 activity, showing a stabilisation of cristae in the context of COX-2 overexpression after I/R. On the other hand, a retrospective study was conducted in patients who had undergone liver transplantation. In this part of the study, PGE2 levels were analysed and correlated with liver functions after transplantation. This analysis shows that the presence of PGE2 in the plasma of recipients correlates with a better prognosis, while lower PGE2 levels are associated with early graft dysfunction. All these results present COX-2 as a new player in liver protection after I/R, showing an anti-inflammatory and antioxidant role, as well as reducing mitochondrial damage, cell stress and cell death. Furthermore, it is shown how COX-2-derived prostaglandins under physiological conditions can play a protective role in cases of liver transplant.