Estudio in vitro de la modulación ejercida por los neutrófilos y la NETosis sobre las células en elcáncer vesical

Abstract

[ES] El cáncer vesical es la enfermedad urológica más letal, encontrándose dentro del grupo de las neoplasias más frecuentes a nivel mundial. Existen diferentes mecanismos asociados a los distintos tipos de cáncer y que, por ende, favorecen la progresión de la enfermedad, entre los que cabe destacar la presencia de neutrófilos y sus funciones asociadas. Los neutrófilos son el tipo de glóbulo blanco más abundante del sistema inmunitario. Tras su activación presentan mecanismos de defensa del organismo como la fagocitosis, degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Los NETs son redes extracelulares liberadas por el propio neutrófilo en un proceso denominado NETosis. Estas redes están formadas por ADN recubierto de histonas y diversas proteínas presentes en el citoplasma o en los gránulos de los neutrófilos. Aunque los NETs presentan un papel crucial a la hora de defender al organismo contra las infecciones, también se ha visto su implicación en condiciones no infecciosas como en la progresión del cáncer y la inmunotrombosis, entre otras.

En este trabajo se ha estudiado el efecto de los NETs, en la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer vesical. Para ello se obtuvieron NETs a partir de neutrófilos de voluntarios sanos estimulados con PMA. Se realizaron ensayos in vitro de migración, proliferación e invasión con tres líneas celulares: T24 (cáncer vesical transicional de grado 3), 5637 (cáncer vesical de grado 2) y SV-HUC1 (urotelio sano), las cuales se trataron con diferentes concentraciones de NETs. El tratamiento con NETs de las células T24 de subtipo más grave disminuyó su capacidad de migración, mientras que no modificó su capacidad de proliferación o invasión. El tratamiento con concentraciones altas de NETs de las células de cáncer vesical 5637 de subtipo más leve disminuyó su capacidad de invasión, mientras que no modificó su capacidad de proliferación o migración. Por último, el tratamiento con concentraciones bajas de NETs de las células SV-HUC 1 de urotelio sano aumentó su capacidad de proliferación, mientras que las concentraciones altas de NETs parecen ser citotóxicas, disminuyendo su capacidad de proliferación. Los NETs no modifican su capacidad de invasión.

Así mismo, para evaluar el entorno procoagulante en el ambiente tumoral se realizaron ensayos de test de generación de trombina (TGT), para estudiar en primer lugar, el efecto tanto de las líneas celulares como de sus medios condicionados y los NETs en la generación de trombina. En un segundo ensayo se quiso estudiar la posible alteración del estado procoagulante del entorno tumoral tras tratar las células con NETs. Se observó que las células tumorales y sus medios condicionados, estos últimos en menor medida, incrementan la generación de trombina por la vía extrínseca de la coagulación y de manera mucho más rápida en comparación con el pool de plasma. Los NETs por su parte generaron un aumento en la generación de trombina por la vía intrínseca de la coagulación. El tratamiento con NETs de las células de cáncer vesical T24 de subtipo más grave disminuyó el estado procoagulante del entorno tumoral, posiblemente porque promuevan la supervivencia celular. El tratamiento con NETs de las células de cáncer vesical 5637 de subtipo más leve no modificó el estado procoagulante del entorno tumoral. Mientras que el tratamiento con concentraciones altas de NETs de las células SV-HUC-1 de urotelio sano aumentó el estado procoagulante de su entorno, posiblemente por resultar citotóxicos promoviendo la muerte celular, resultados que concuerdan con los obtenidos en los ensayos de proliferación.

[EN] Bladder cancer is the most lethal urological disease and is one of the most frequent neoplasms worldwide. There are different mechanisms associated with different types of cancer and thus favour disease progression, including the presence of neutrophils and their associated functions. Neutrophils are the most abundant type of white blood cell in the immune system. Upon activation, they exhibit defence mechanisms of the organism such as phagocytosis, degranulation and the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs are extracellular networks released by the neutrophil itself in a process called NETosis. These networks consist of histone coated DNA and various proteins present in the cytoplasm or granules of neutrophils. Although NETs play a crucial role in defending the body against infection, they have also been implicated in non-infectious conditions such as cancer progression and immunothrombosis, among others.

In this work, the effect of NETs on the proliferation, migration and invasion of bladder cancer cells was studied. For this purpose, NETs were obtained from neutrophils of healthy volunteers stimulated with PMA. In vitro migration, proliferation and invasion assays were performed with three cell lines: T24 (transitional grade 3 bladder cancer), 5637 (grade 2 bladder cancer) and SV HUC1 (healthy urothelium), which were treated with different concentrations of NETs. NETs treatment of the most severe subtype T24 cells decreased their ability to migrate, while it did not change their ability to proliferate or invade. Treatment of the mildest subtype 5637 bladder cancer cells with high concentrations of NETs decreased their invasiveness, while it did not change their ability to proliferate or migrate. Finally, treatment of healthy urothelial SV-HUC-1 cells with low concentrations of NETs increased their proliferative capacity, whereas high concentrations of NETs appear to be cytotoxic, decreasing their proliferative capacity. NETs do not modify their invasiveness.

In addition, to evaluate the procoagulant status of the tumour environment, thrombin generation tests (TGT) were performed to study the effect of both the cell lines and their conditioned media and NETs on thrombin generation. In a second assay, we wanted to study the possible alteration of the procoagulant state of the tumour environment after treating the cells with NETs. It was observed that tumour cells and their conditioned media, the latter to a lesser extent, increase thrombin generation via the extrinsic coagulation pathway and much more rapidly compared to a healthy plasma pool. NETs, on the other hand, increased thrombin generation via the intrinsic coagulation pathway. NETs treatment of the more severe subtype T24 bladder cancer cells with NETs decreased the procoagulant state of the tumour environment, possibly because they promote cell survival. NETs treatment of the milder subtype 5637 bladder cancer cells did not change the procoagulant status of the tumour environment. While treatment of healthy SV-HUC-1 urothelial cells with high concentrations of NETs increased the procoagulant status of their environment, possibly because they are cytotoxic and promote cell death, results that are consistent with those obtained in the proliferation assays.