Diseño de hidrogeles de gelatina con rigidez controlada para modelar la fibrosis hepática

Abstract

[ES] En la actualidad, la fibrosis hepática es una de las patologías que más prevalecen en la población y de la que no existen medicamentos efectivos para revertirla. Por ello, surge la necesidad de desarrollar fármacos antifibróticos que puedan ser testados enplataformas de pruebas preclínicas (in vitro) que sean robustas y reproduzcan las condiciones del hígado humano, para reducir la experimentación animal (que muchas veces no es ideal ya que se aleja del comportamiento humano). En los últimos años la ingeniería tisular se ha volcado a estas aplicaciones y posee numerosas investigaciones en esta línea. Concretamente, son interesantes los hidrogeles como mimetizadores muy cercanos a la matriz extracelular (ECM)hepática natural, tanto encondiciones sanas como patológicas. Las propiedades mecánicas de dicha ECM son clave para el desarrollo y la inhibición de la progresión de la fibrosis. Gracias a la posibilidad de variar la composición y las propiedades de estos materiales, es posible crear un entorno 3D para las células con las características de la ECM fibrótica, para luego suministrarles los fármacos en desarrollo y observar el efecto antifibrótico. La adición a los hidrogeles de moléculas clave promotoras de la fibrosis, como lo es la lisil oxidasa(LOx), proporciona unas condiciones idóneas para incrementar la rigidez del hidrogel para simular mejor el entorno del hígado fibrótico que las células sentirán en el hidrogel, tal y como ocurre en el organismo con la ECM, que es rígida en la fibrosis hepática. En el presente trabajo final de Máster (TFM), se ha probado la estrategia del uso de la LOx para conseguir hidrogeles rígidos que imiten la ECM de hígado fibrótico. Como la estrategia no ha dado buenos resultados (no se ha conseguido rigidizar la matriz), se ha empleado el compuesto Glioxal (GlyO), con el que sí se hanconseguido condiciones de hidrogel imitador de la fibrosis.La estrategia GlyO se ha realizado con scaffolds fabricados de gelatina, a los que se les ha sembrado células hepáticas y endoteliales (presentes en el hígado y con actividad alta durante la fibrosis), una vez liofilizados y rigidizados. Se han caracterizado los hidrogeles mecánicamente y se han realizado cultivos celulares para comprobar que la plataforma propuesta es un entorno adecuado para simular el hígado fibrótico in vitro. Los resultados han sido prometedores – un scaffold que mimetiza la fase 1 de la fibrosis (5 kPa de módulo elástico a cizalla) y en el que se ha visto supervivencia de los tipos celulares HepG2, HUVEC y hepatocitos primarios porcinos – y abren el camino hacia el desarrollo de entornos 3D de hidrogeles capaces de simular la fibrosis hepática.

[EN] Currently, liver fibrosis is one of the most prevalent pathologies in the population and there are no effective drugs to reverse it. Therefore, there is a need to develop anti-fibrotic drugs that can be tested in preclinical (in vitro) test platforms that are robust and reproduce human liver conditions, in order to reduce animal experimentation (which is often not ideal as it is far from human behaviour). In recent years, tissue engineering has turned to these applications and there is a great deal of research in this field. In particular, hydrogels are of interest as mimics of the natural liver extracellular matrix (ECM), both in healthy and pathological conditions. The mechanical properties of such ECM are key to the development and inhibition of fibrosis progression. By varying the composition and properties of these materials, it is possible to create a 3D environment for cells with the characteristics of the fibrotic ECM, then deliver the developing drugs to them and observe the anti-fibrotic effect. Theaddition of key fibrosis-promoting molecules such as lysyl oxidase (LOx) to the hydrogels provides ideal conditions for increasing the stiffness of the hydrogel to better simulate the fibrotic liver environment that the cells will feel in the hydrogel, as occurs in the body with the ECM, which is stiff in liver fibrosis. In this Master's thesis, the strategy of using LOx to obtain rigid hydrogels that mimic the ECM of fibrotic liver has been tested. As the strategy did not give good results (it was not possible to stiffen the matrix), the compound Glyoxal (GlyO) was used, with which fibrosis-mimicking hydrogel conditions were achieved. The GlyO strategy was carried out using gelatin scaffolds, which were seeded with liver and endothelial cells (present in the liver and highly active during fibrosis), after freeze-drying and stiffening. The hydrogels have been mechanically characterised and cell cultures have been performed to verify that the proposed platform is a suitable environment to simulate fibrotic liver in vitro. The results are promising - a scaffold mimicking fibrosis stage 1 (5 kPa shear elastic modulus) and showing survival of HepG2, HUVEC and primary porcine hepatocytes - and pave the way towards the development of 3D hydrogel environments capable of simulating liver fibrosis.