Functional and evolutionary genomics of antibiotic resistance in tuberculosis: from biology to global DR-TB control

Abstract

[ES] La resistencia a los antibióticos en la tuberculosis es un grave problema de salud mundial y un obstáculo creciente para el control de la enfermedad. En esta tesis utilizamos la genómica como herramienta para estudiar diferentes aspectos de la biología de la bacteria en relación con el desarrollo de resistencia a los antibióticos y aportar nuevos conocimientos para afrontar el reto de su erradicación.

En primer lugar, caracterizamos los nuevos determinantes genómicos de la resistencia a isoniazida utilizando un enfoque basado en genómica funcional y asociación filogenética. El método consiste en la secuenciación de transposones de bacterias expuestas al antibiótico para determinar los genes implicados tanto en sensibilidad como en resistencia, y su filtrado con datos genómicos de una colección global de cepas clínicas. Hemos comprobado la importancia de las rutas metabólicas de síntesis de la pared bacteriana en el mecanismo de acción de los antibióticos, y también hemos descubierto nuevos genes implicados en el equilibrio redox celular que confieren resistencia de bajo nivel. Estos resultados pueden utilizarse para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico o dianas terapéuticas, y el método es aplicable a nuevos antibióticos para predecir futuros determinantes de resistencia.

En segundo lugar, exploramos la diversidad bacteriana de la tuberculosis en su sitio natural de infección. Hemos analizado muestras de diferentes partes de la lesión pulmonar de pacientes en Georgia, un país con una alta incidencia de tuberculosis resistente, y hemos detectado un número significativo de infecciones policlonales (causadas por dos o más cepas diferentes). Estas diferentes cepas pueden a su vez ser resistentes a diferentes antibióticos, por lo que es fundamental detectarlas a tiempo. Las muestras quirúrgicas nos dieron una imagen más completa de la diversidad bacteriana que el esputo de rutina, y nos permitieron detectar infecciones policlonales con mayor precisión. Este tipo de infecciones se están subestimando en países con alta carga de TB y pueden afectar negativamente al resultado del tratamiento, por lo que en estos entornos sería recomendable una segunda muestra durante el curso del régimen de antibióticos.

Y en tercer lugar, evaluamos el papel del VIH en el desarrollo de resistencias durante las primeras semanas de tratamiento. Para ello, hemos tomado muestras de pacientes de Mozambique con y sin VIH de forma seriada durante el primer mes para analizar cuál es el impacto de la coinfección en las presiones selectivas inmunes y antibióticas. Hemos detectado una mayor diversidad total en los pacientes seronegativos y, en comparación, los pacientes VIH+ presentan dificultades para eliminar esta diversidad durante las etapas tempranas del tratamiento que podrían afectar a su éxito. Gracias a la secuenciación profunda, también hemos podido observar una acumulación de variantes en genes relacionados con resistencia, y hemos asociado algunas de ellas a cambios en las CMI (concentraciones mínimas inhibitorias) de las muestras. Estos pequeños cambios tempranos pueden servir como predictores de una menor capacidad para eliminar la diversidad bacteriana, y podrían indicar un futuro fallo de tratamiento.

En resumen, en esta tesis nos hemos centrado en entender mejor los factores bacterianos y del hospedador que impactan el desarrollo de la tuberculosis resistente a antibióticos y como resultado permitirán desarrollar nuevos diagnósticos y modelos epidemiológicos para controlarla. La secuenciación genómica es una gran herramienta para estudiar éste y otros patógenos y ofrece la posibilidad de detectar resistencias rápidamente y con alta precisión en el ámbito clínico. Un correcto diagnóstico asegura un tratamiento adecuado, más corto y exitoso, y además previene la transmisión a nuevos huéspedes. Las técnicas y resultados expuestos aquí contribuyen a lograr estos objetivos y mejorar el control global de la epidemia de TB resistente.

[CA] La resistència als antibiòtics a la tuberculosi és un greu problema de salut mundial i un obstacle creixent per al control de la malaltia. En aquesta tesi utilitzem la genòmica com a eina per estudiar diferents aspectes de la biologia del bacteri en relació amb el desenvolupament de resistència als antibiòtics i aportem nous coneixements per fer front al repte de la seua eradicació.

En primer lloc, caracteritzem els nous determinants genòmics de la resistència a isoniazida utilitzant una aproximació basada en genòmica funcional i associació filogenètica. El mètode consisteix en la seqüenciació de transposons de bacteris exposats a l'antibiòtic per determinar els gens implicats tant en sensibilitat com en resistència, i el filtratge amb dades genòmiques d'una col·lecció global de soques clíniques. Hem comprovat la importància de les rutes metabòliques de síntesi de la paret bacteriana en el mecanisme d'acció dels antibiòtics, i també hem descobert nous gens implicats en l'equilibri redox cel·lular que confereixen resistència de baix nivell. Aquests resultats es poden utilitzar per desenvolupar noves tècniques de diagnòstic o dianes terapèutiques, i el mètode és aplicable a nous antibiòtics per predir futurs determinants de resistència.

En segon lloc, explorem la diversitat bacteriana de la tuberculosi al seu lloc natural d'infecció. Hem analitzat mostres de diferents parts de la lesió pulmonar de pacients de Geòrgia, un país amb alta incidència de tuberculosi resistent, i hem detectat un nombre significatiu d'infeccions policlonals (causades per dues o més soques diferents). Aquestes soques poden ser resistents a diferents antibiòtics, per la qual cosa és fonamental detectar-les a temps. Les mostres quirúrgiques ens van donar una imatge més completa de la diversitat bacteriana que l'esput de rutina, i ens van permetre detectar infeccions policlonals amb més precisió. Aquest tipus d'infeccions s'estan subestimant en països amb alta càrrega de TB i poden afectar negativament el resultat del tractament, per això en aquests entorns seria recomanable una segona mostra durant el curs del règim d'antibiòtics.

I en tercer lloc, avaluem el paper del VIH en el desenvolupament de resistències durant les primeres setmanes de tractament. Per això, hem pres mostres de pacients de Moçambic amb i sense VIH de manera seriada durant el primer mes per analitzar quin és l'impacte de la coinfecció en les pressions selectives immunes i antibiòtiques. Hem detectat una major diversitat total en els pacients seronegatius i, en comparació, els pacients VIH+ presenten dificultats per eliminar aquesta diversitat durant les primeres etapes del tractament que podrien afectar el seu èxit. Gràcies a la seqüenciació profunda, també hem pogut observar una acumulació de variants en gens relacionats amb resistència, i n'hem associat algunes a canvis en les CMI (concentracions mínimes inhibitòries) de les mostres. Aquests petits canvis primerencs poden servir com a predictors d'una capacitat menor per eliminar la diversitat bacteriana, i podrien indicar un futur fracàs del tractament.

En resum, en aquesta tesi ens hem centrat a entendre millor els factors bacterians i de l'hoste que impacten el desenvolupament de la tuberculosi resistent a antibiòtics i com a resultat permetran desenvolupar nous diagnòstics i models epidemiològics per controlar-la. La seqüenciació genòmica és una gran eina per estudiar aquest i altres patògens i ofereix la possibilitat de detectar resistències ràpidament i amb alta precisió a l'àmbit clínic. Un diagnòstic correcte assegura un tractament adequat, més curt i exitós, i prevé la transmissió a nous hostes. Les tècniques i els resultats exposats aquí contribueixen a assolir aquests objectius i millorar el control global de l'epidèmia de tuberculosi resistent.

[EN] Antibiotic resistance in tuberculosis is a serious global health problem and a growing obstacle to the control of the disease. In this thesis we use genomics as a tool to study different aspects of the biology of the bacterium in relation to the development of antibiotic resistance and provide new knowledge to meet the challenge of its eradication.

First, we characterize new genomic determinants of resistance to isoniazid by using an approach based on functional genomics and phylogenetic association. The method consists of transposon sequencing of bacterial populations exposed to the antibiotic to determine the genes involved in both sensitivity and resistance, and their filtering with genomic data from a global collection of clinical strains. We have verified the importance of the metabolic pathways of bacterial wall synthesis in the mechanism of antibiotic action, and also discovered new genes involved in cellular redox balance that confer low-level resistance to the bacteria. These results can be used to develop new diagnostic techniques or therapeutic targets, and the method is applicable to new antibiotics to predict future resistance determinants.

Second, we explored the bacterial diversity of tuberculosis at its natural site of infection and the population dynamics of antibiotic resistance. We have analyzed samples from different parts of the lung lesion from patients in Georgia, a country with a high incidence of resistant tuberculosis, and detected a significant number of polyclonal infections (caused by two or more different strains). These different strains can in turn be resistant to different antibiotics, which makes it essential to detect them in time to offer the patient the most appropriate treatment possible. The surgical specimens gave us a more complete picture of bacterial diversity than sputum, the routine clinical specimen, and allowed us to detect polyclonal infections more accurately. The data show that we are underestimating these types of infections in high TB burden countries and they may adversely affect treatment outcome, so in these settings a second sampling during the course of the antibiotic regimen would be advisable.

Third, we evaluated the role of one of the most important comorbidities of tuberculosis, HIV, in the development of resistance during the first weeks of treatment. To this end, we have sampled patients from Mozambique with and without HIV on a serial basis during the first month to analyze the impact of co-infection on both immune and antibiotic selective pressures. We have detected a higher total diversity in seronegative patients and furthermore, in comparison, HIV+ patients present difficulties in eliminating this diversity during the early stages of treatment that could affect their success. Thanks to deep sequencing, we have also been able to observe an accumulation of variants in resistance-related genes, and we have associated some of them with changes in the MICs (minimum inhibitory concentrations) of the samples. These small changes during the first month may serve as predictors of a reduced ability to eliminate bacterial diversity, and could indicate future treatment failure.

In summary, in this thesis we have focused on better understanding the bacterial and host factors that have an impact on the development of antibiotic resistant tuberculosis and as a result will allow the development of new diagnostics and epidemiological models to control it. Genomic sequencing is a great tool to study this and other pathogens in real time, and offers the possibility of detecting resistance quickly and with high certainty in the clinical setting. A correct diagnosis ensures adequate, shorter and more successful treatment, and also prevents transmission to new hosts. The techniques and results presented here contribute to achieve these objectives and improve the global control of the resistant tuberculosis epidemic.