Study of the Physiological, Metabolomic and Transcriptional Changes Mediated by Rootstocks to Explain the Water Stress Tolerance of Grafted Pepper Plants

Abstract

[ES] Anteriormente, investigadores del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) y la Universidad Politécnica de Valencia (UPV) evaluaron la respuesta a estrés hídrico en pimiento injertado para obtener patrones de pimiento que confieran tolerancia a la variedad injertada en estrés hídrico. Los mejores patrones se estudian en campo en condiciones de estrés hídrico a largo plazo. Se patentó el patrón híbrido de pimiento NIBER® tolerante a estrés hídrico, las plantas injertadas sobre NIBER® mostraron menor impacto en la biomasa y el rendimiento en déficit hídrico a largo plazo. La tolerancia de NIBER® se atribuyó al mantenimiento de la actividad fotosintética y una mejor distribución de la biomasa radicular en estrés hídrico. Además, la respuesta sostenida de tolerancia observada en las plantas injertadas sobre NIBER® podría relacionarse con una respuesta rápida en la fase inicial en estrés hídrico, que no se conoce a corto plazo. Así, estudiar la contribución de la respuesta a corto plazo de NIBER® sobre la tolerancia de la variedad injertada en estrés hídrico arrojaría luz en las estrategias de tolerancia en plantas injertadas de pimiento. Además, estudiar la modulación génica, el balance hormonal y el perfil metabólico ampliará el conocimiento sobre los mecanismos moleculares en la respuesta a estrés hídrico. En esta tesis doctoral, observamos que los mecanismos constitutivos en ausencia de estrés hídrico influyen en la respuesta a estrés hídrico en plantas injertadas de pimiento, y que las estrategias constitutivas de NIBER® incluyen la estimulación del sistema antioxidante y la inducción sostenida de ABA. En estrés hídrico, las raíces de NIBER® muestran un menor impacto que las raíces de A10, dado su menor contenido de GSSG por menor daño oxidativo. NIBER® promueve la síntesis de osmolitos en la raíz y vitamina B6 en las hojas de la variedad injertada protegiendo al aparato fotosintético del daño oxidativo producido por el estrés hídrico. Además, la prolina, implicada en la protección del aparato fotosintético, se acumula en las plantas injertadas sobre el híbrido de pimiento H92, capaces de mantener la actividad fotosintética a largo plazo en estrés hídrico. Este rol de la prolina en la tolerancia a estrés hídrico a largo plazo no se observó a corto plazo y podría ser una estrategia tardía. La respuesta al estrés hídrico a corto plazo incluye la regulación del movimiento estomático en NIBER® en la fase inicial de estrés (5 h), evitando el cierre estomático hasta las 48 h mediante cambios en la expresión génica de reguladores negativos de ABA y acuaporinas, seguido del cierre estomático a las 48 h asociado a una síntesis previa de ABA en las raíces y transporte a las hojas. El JA también aumentó en las hojas de la variedad injertada sobre NIBER® (48 h) en estrés hídrico, y se regula por señales a larga distancia desde la raíz, que promueven la síntesis en hoja y el transporte a la raíz, y su resíntesis. El JA está implicado en el cierre estomático y la señalización en estrés, causando la activación de factores de transcripción de respuesta a la deshidratación. En las raíces de NIBER® el ratio auxinas/citoquininas se regula en la respuesta inicial al estrés hídrico, favoreciendo el crecimiento de la raíz respecto al tallo a las 5 h, después aumentando las citoquininas y disminuyendo las auxinas a 24 h y finalmente aumentando las auxinas y reduciendo las citoquininas para una mayor biomasa radicular y capacidad exploratoria. En las hojas de la variedad injertada, NIBER® aumenta los metabolitos protectores clorofila a, ácido esteárico, antocianinas y metabolitos implicados en la síntesis de suberina y cutina. Estos últimos también aumentan en la raíz y tienen un papel antioxidante o bien como constituyentes de barreras celulares controlando los flujos de agua, gases y solutos. Finalmente, el contenido en sirohemo aumenta en la raíz y posiblemente está relacionado con una asimilación del nitrógeno más eficiente.

[CA] Prèviament, investigadors de l'Institut Valencià d'Investigacions Agràries (IVIA) i de la Universitat Politècnica de València (UPV) avaluaren la resposta a estrés hídric en pebrera empeltada per obtenir patrons de pebrera que conferisquen tolerància a la varietat empeltada en estrés hídric. Els millors patrons s'estudien al camp en condicions d'estrés hídric a llarg termini. Es va patentar el patró híbrid de pebrera NIBER® com a patró tolerant, les plants empeltades sobre NIBER® mostraren menor impacte en la biomassa i el rendiment en condicions de dèficit hídric. La tolerància de NIBER® es va atribuir al manteniment de l'activitat fotosintètica i a una millor distribució de la biomassa radicular en estrés hídric. A més, la resposta sostinguda de tolerància observada a les plantes empeltades sobre NIBER® podria relacionar-se amb una resposta ràpida a la fase inicial en estrés hídric, que no s'ha estudiat a curt termini. Així, estudiar la contribució de la resposta a curt termini de NIBER® sobre la tolerància de la varietat empeltada en estrés hídric aclariria els mecanismes de tolerància en plantes empeltades de pebrera. A més, estudiar la modulació gènica, el balanç hormonal i el perfil metabòlic ampliaria el coneixement sobre els mecanismes moleculars en la resposta a estrés hídric. En aquesta tesi doctoral comprovarem que els mecanismes constitutius en absència d'estrés hídric influeixen en la resposta a estrés hídric en plantes empeltades de pebrera i que les estratègies constitutives de NIBER® inclouen l'estimulació del sistema antioxidant i la inducció sostinguda d'ABA. En estrés hídric, les arrels de NIBER® mostraren menor impacte en comparació amb A10, amb un menor contingut de GSSG per menor dany oxidatiu. NIBER® promou la síntesis d'osmòlits a les arrels i de vitamina B6 a les fulles de la varietat empeltada per a protegir a l'aparell fotosintètic del dany oxidatiu per l'estrés hídric. A més, la prolina, implicada en la protecció de l'aparell fotosintètic, s'acumula a les plantes empeltades sobre l'híbrid de pebrera H92, que mantenen l'activitat fotosintètica en condicions d'estrés hídric a llarg termini. Aquest paper de la prolina no es va observar en condicions d'estrés hídric a curt termini i podria ser una estratègia tardana. Les respostes a l'estrés hídric a curt termini inclouen la regulació del moviment estomàtic en NIBER® a la fase inicial d'estrés hídric (5 h), evitant el tancament estomàtic fins a les 48 h mitjançant canvis a l'expressió gènica de reguladors negatius d'ABA i acuaporines, seguit d'un tancament estomàtic a les 48 h associat a una síntesis prèvia d'ABA a les arrels i transport a les fulles. L'JA també va augmentar a les fulles de la varietat empeltada sobre NIBER® a les 48 h en estrés hídric i està regulat per senyals a llarga distància des de les arrels que promouen la síntesis a les fulles i el transport a les arrels i resíntesi. L'JA està implicat al tancament estomàtic i la senyalització en condicions d'estrés, promovent l'activació de factors de transcripció de resposta a la deshidratació. El rati auxines/citoquinines es regula a les arrels de NIBER® a la resposta inicial a l'estrés hídric, primer afavorint el creixement de l'arrel sobre el creixement de la part aèria a les 5 h, després augmentant les citoquinines i disminuint les auxines a les 24 h i finalment augmentant les auxines i reduint les citoquinines per obtenir major biomassa radicular i capacitat exploratòria. A les fulles de la varietat empeltada, NIBER® augmenta el contingut dels metabòlits protectors clorofil·la a, àcid esteàric, antocianines i metabòlits relacionats amb la síntesi de suberina i cutina. Aquests últims també augmenten a les arrels i tenen un paper antioxidant o actuen com a constituents de barreres cel·lulars controlant els fluxos d'aigua, gasos i soluts. Finalment, el contingut en siroheme augmenta a les arrels i possiblement està relacionat amb una assimilació de nitrogen més eficient.

[EN] Previously, research groups at the Valencian Institute of Agricultural Research (IVIA) and the Polytechnic University of Valencia (UPV) evaluated the water stress responses in grafted pepper plants to obtain tolerant pepper rootstocks that make the grafted variety able to overcome water stress. The best rootstocks are studied in the field under long-term water stress conditions. In this way, the NIBER® pepper hybrid rootstock was obtained and patented as water stress-tolerant rootstock, because plants grafted onto NIBER® had a lower impact on biomass and yield under long-term deficit irrigation conditions. NIBER® tolerance response was attributed to sustained photosynthetic activity and improved root biomass distribution under long-term water stress. However, the sustained tolerance response observed in plants grafted onto NIBER® may be linked to prompt responses in the early phase of water stress conditions, but the short-term modulation and behavior of NIBER® water stress response has not been studied. Hence, studying the contribution of the NIBER® short-term water stress responses to tolerance in the grafted variety would shed light into tolerance mechanisms in grafted pepper plants. Moreover, understanding the modulation of the gene expression, phytohormones balance and metabolic profile will also broad the knowledge on the molecular mechanisms implicated in water stress response. In the present doctoral thesis, we stated that the constitutive mechanisms taking place under non-water stress conditions dispose the response to water stress in grafted pepper plants, and NIBER® constitutive strategies include an enhanced ROS detoxification system and maintained ABA induction. When the water stress comes into play, its impact was minor in NIBER® roots in relation to A10 roots, which is reflected in lesser GSSG content from lower oxidative damage. NIBER® promotes the synthesis of osmolytes in roots and vitamin B6 in the grafted variety leaves to protect the plants from the oxidative damage resulting from water stress. Moreover, proline has a role in photosynthetic apparatus protection, because it is accumulated in plants grafted onto pepper hybrid H92, which showed sustained photosynthetic activity under long-term water stress conditions. The proline role in water stress tolerance is not observed under short-term water stress and may constitute a late strategy in grafted pepper plants. Short-term responses to water stress include stomatal movements in NIBER® during early phases (5h) of water stress, starting with the avoidance of stomatal closure up to 48 h by gene expression changes in ABA negative regulators and aquaporins, and followed by stomatal closure at 48 h associated with previous ABA synthesis in roots and transport to leaves. JA is also increased in the leaves of the variety grafted onto NIBER® at 48 h under water stress, and is regulated by long-distance signals from roots that promote its synthesis on leaves and transport to roots and resynthesis. JA is involved in stomatal closure and stress signaling, which leads to dehydration-responsive transcription factors activation. The auxins/cytokinins ratio is also fine-tuned by NIBER® roots during the early water stress response, beginning with promotion of root over shoot growth at 5 h, then increases the cytokinins and reduces the auxins content at 24 h, and finally increases the auxins and reduces the cytokinins content to obtain higher root biomass and greater water exploring ability. In the leaves of the grafted variety, NIBER® increases protective metabolites as chlorophyll a, stearic acid, anthocyanins and suberin and cutin biosynthesis-related metabolites, being the latter also increased in the roots. The mentioned metabolites have an antioxidant role or act as cellular barrier constituents that can control fluxes of water, gases and solutes. Lastly, siroheme increases in roots and it is possibly linked to a more effective nitrogen assimilation.