Sperm Quality and Cryopreservation in Teleost: Effect of Seminal Plasma Component and Climate Change

Abstract

[ES] La selección de gametos de alta calidad es un requisito indispensable a tener en cuenta en los programas de reproduccion asistida. El desarrollo de herramientas biotecnológicas como la criopreservación de gametos, juega un papel importante en la producción acuicola y en la formación de bancos de germoplasma, que contribuiran luego en la mejora genética de las poblaciónes de peces, principalmente aquellas en peligro y que pudieran estar más afectadas ante futuros cambios climáticos. En la primera fase de esta tesis realizada en la Unesp, se trabajó con una especie neotropical de elevada importancia económica para la region Suramericana. La segunda fase realizada en la UPV se trabajó con la Anguila europea (Anguilla anguilla), una especie clasificada en la Lista Roja de la (UICN) como especie "en peligro crítico de extinción". En la primera fase se buscó caracterizar la composición bioquímica del plasma y las características seminales de la especie para evaluar las posibles relaciones entre estos parámetros. El plasma seminal estuvo principalmente compuesto por iones de sodio (Na+) y dentro de los componentes orgánicos sobresalieron las proteínas totales y la glucosa. A través del análisis de componentes principales (PCA) se observó que la motilidad tenía una fuerte correlación positiva con el tiempo de motilidad, la concentración de espermatozoides y las proteínas totales. Estos análisis sirvieron de base para la creación de una solución diluyente utilizada posteriormente en la sustancia crioprotectora. Luego se determinó la influencia del plasma seminal como constituyente de la solución crioprotectora en la criopreservación de semen de P. reticulatum. Se utilizaron tres tratamientos: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a este crioprotector se le agregó 30% de plasma seminal natural (T2) y 30% de plasma seminal artificial en base a los resultados de los componentes bioquímicos del plasma determinados para la especie en el experimento anterior (T3). Se evaluaron parámetros de motilidad espermática, capacidad fecundante del semen criopreservado, así como fragmentación del ADN. El tratamiento T1 resultó con los mejores valores de motilidad seguido del T2, y la capacidad fertilizante de estos dos tratamientos fue similar al control, sin embargo, el tratamiento T2 mostró menos daño en el ADN. Mediante el PCA se demostró que T1 tenía una mejor relación positiva con la fertilidad y la motilidad total y progresiva. Finalmente, evaluamos las estructuras de las subpoblaciones espermáticas en cada uno de los tratamientos utilizados. Mediante análisis multivariado en dos etapas, fue posible determinar tres subpoblaciones espermáticas en el semen crioconservado de la especie, SP1 (rápido-lineal), SP2 (rápido-no lineal) y SP3 (lento-lineal). T1 presentó el mayor porcentaje de SP1, siendo confirmado por la efectividad en la protección de las células de este tratamiento en el proceso de criopreservación de la especie. En la segunda fase que se está llevó a cabo en la UPV, el objetivo general fue determinar el efecto de la temperatura y el pH del agua de mar sobre la motilidad de los espermatozoides en la Anguila europea. Se determinó que el bajo pH del agua de mar (6.5-7.4) disminuyó la motilidad de los espermatozoides de anguila en comparación con el control (pH= 8.2). Cuando estudiamos el efecto combinado del pH del plasma seminal artificial y el pH de ASW (7.8 y 8.2), no encontramos diferencias estadísticas en la motilidad y cinética de los espermatozoides en relación con el pH del plasma seminal artificial, pero sí el pH del agua de mar. Se encontraron valores más altos de motilidad total (MOT), FA(rápidos) y ME (médios) con un pH de 8.2 que con un pH de 7.8. En contraste, la temperatura del agua de mar no afectó los parámetros de motilidad de los espermatozoides o la longevidad de los espermatozoides en el contexto del cambio climático.

[CA] La selecció de gàmetes d'alta qualitat és un requisit indispensable a tenir en compte en els programes de reproducció assistida. El desenvolupament d'eines biotecnològiques com la criopreservació de gàmetes, juga un paper important en la producció aqüicola i en la formació de bancs de germoplasma, que contribuiran després a la millora genètica de les població de peixos, principalment aquelles en perill i que poguessin estar més afectades davant de futurs canvis climàtics. A la primera fase d'aquesta tesi realitzada a la Unesp, es va treballar amb una espècie neotropical d'elevada importància econòmica per a la regió sud-americana. La segona fase realitzada a la UPV es va treballar amb l'Anguilla europea (Anguilla anguilla), una espècie classificada a la Llista Vermella de la (UICN) com a espècie "en perill crític d'extinció". A la primera fase es va buscar caracteritzar la composició bioquímica del plasma i les característiques seminals de l'espècie per avaluar les possibles relacions entre aquests paràmetres. El plasma seminal va estar principalment compost per ions de sodi (Na+) i dins dels components orgànics van sobresortir les proteïnes totals i la glucosa. A través de l'anàlisi de components principals (PCA), es va observar que la motilitat tenia una forta correlació positiva amb el temps de motilitat, la concentració d'espermatozoides i les proteïnes totals. Aquestes anàlisis van servir de base per a la creació d'una solució diluent utilitzada posteriorment a la substància crioprotectora. Després es va determinar la influència del plasma seminal com a constituent de la solució crioprotectora en la criopreservació de semen de P. reticulatum. Es van utilitzar tres tractaments: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a aquest crioprotector se li va afegir 30% de plasma seminal natural (T2) i 30% de plasma seminal artificial sobre la base dels resultats dels components bioquímics del plasma determinats per a l'espècie a l'experiment anterior (T3). S'avaluaren paràmetres de motilitat espermàtica, capacitat fecundant del semen criopreservat, així com fragmentació de l'ADN. El tractament T1 va resultar amb els millors valors de motilitat seguit del T2, i la capacitat fertilitzant d'aquests dos tractaments va ser similar al control, però el tractament T2 va mostrar menys mal a l'ADN. Mitjançant el PCA es va demostrar que T1 tenia una millor relació positiva amb la fertilitat i la motilitat total i progressiva. Finalment, avaluem les estructures de les subpoblacions espermàtiques a cadascun dels tractaments utilitzats. Mitjançant anàlisi multivariada en dues etapes, va ser possible determinar tres subpoblacions espermàtiques en el semen crioconservat de l'espècie, SP1 (ràpid-lineal), SP2 (ràpid-no lineal) i SP3 (lent-lineal). T1 va presentar el percentatge més gran de SP1, i va ser confirmat per l'efectivitat en la protecció de les cèl·lules d'aquest tractament en el procés de criopreservació de l'espècie. A la segona fase que es va dur a terme a la UPV, l'objectiu general va ser determinar l'efecte de la temperatura i el pH de l'aigua de mar sobre la motilitat dels espermatozoides a l'Anguila europea. Es va determinar que el pH baix de l'aigua de mar (6.5-7.4) va disminuir la motilitat dels espermatozoides d'anguila en comparació del control (pH= 8.2). Quan estudiem l'efecte combinat del pH del plasma seminal artificial i el pH d'ASW (7.8 i 8.2), no trobem diferències estadístiques en la motilitat i la cinètica dels espermatozoides en relació amb el pH del plasma seminal artificial, però sí el pH de l'aigua de mar. Es van trobar valors més alts de motilitat total (MOT), FA(ràpids) i ME (metges) amb un pH de 8.2 que amb un pH de 7.8. En contrast, la temperatura de l'aigua de mar no va afectar els paràmetres de motilitat dels espermatozous o la longevitat dels espermatozous en el context del canvi climàtic.

[EN] The selection of high-quality gametes is an essential requirement to take into account in assisted reproduction programs. The development of biotechnological tools such as cryopreservation of gametes plays an important role in aquaculture production and in the formation of germplasm banks, which will later contribute to the genetic improvement of fish populations, mainly those in danger and that could be more affected by future climate changes. In the first phase of this thesis carried out at Unesp, we worked with a neotropical species of high economic importance for the South American region. The second phase carried out at the UPV worked with the European Eel (Anguilla anguilla), a species classified on the (IUCN) Red List as a "critically endangered" species. In the first phase, we sought to characterize the biochemical composition of the plasma and the seminal characteristics of the species to evaluate the possible relationships between these parameters. The seminal plasma was mainly composed of sodium ions (Na+) and within the organic components, total proteins and glucose stood out. Through principal component analysis (PCA) it was observed that motility had a strong positive correlation with motility time, sperm concentration and total proteins. These analyzes served as the basis for the creation of a diluent solution later used in the cryoprotective substance. Then the influence of seminal plasma as a constituent of the cryoprotectant solution in the cryopreservation of P. reticulatum semen was determined. Three treatments were used: 5% glucose + 10% methanol (T1), 30% natural seminal plasma (T2) and 30% artificial seminal plasma were added to this cryoprotectant based on the results of the determined biochemical components of the plasma. for the species in the previous experiment (T3). Parameters of sperm motility, fertilizing capacity of cryopreserved semen, as well as DNA fragmentation were evaluated. Treatment T1 resulted with the best motility values followed by T2, and the fertilizing capacity of these two treatments was similar to the control, however, treatment T2 showed less DNA damage. Using PCA, it was shown that T1 had a better positive relationship with fertility and total and progressive motility. Finally, we evaluated the structures of the sperm subpopulations in each of the treatments used. Through two-stage multivariate analysis, it was possible to determine three sperm subpopulations in the cryopreserved semen of the species, SP1 (fast-linear), SP2 (fast-nonlinear) and SP3 (slow-linear). T1 presented the highest percentage of SP1, being confirmed by the effectiveness in protecting the cells of this treatment in the cryopreservation process of the species. In the second phase that is being carried out at the UPV, the general objective was to determine the effect of temperature and pH of seawater on sperm motility in the European Eel. It was determined that the low pH of seawater (6.5-7.4) decreased the motility of eel sperm compared to the control (pH= 8.2). When we studied the combined effect of the pH of the artificial seminal plasma and the pH of ASW (7.8 and 8.2), we did not find statistical differences in the motility and kinetics of the sperm in relation to the pH of the artificial seminal plasma, but we did find the pH of the water of sea Higher values of total motility (MOT), FA (fast) and ME (medium) were found at a pH of 8.2 than at a pH of 7.8. In contrast, seawater temperature did not affect sperm motility parameters or sperm longevity in the context of climate change.