Desarrollo de una polisonda para la detección simultánea de los principales virus que afectan a las cucurbitáceas en España y construcción de un clon infeccioso del cucumber green mottle mosaic virus

Abstract

[ES] El cultivo de cucurbitáceas como son el pepino, la sandía, el melón o el calabacín, presenta una gran relevancia económica tanto a nivel mundial como a nivel nacional. La producción de estos cultivos ha aumentado significativamente en los últimos años y con ella, la llegada de virus y/o vectores virales a nuevas regiones geográficas. Uno de los virus que muestra una mayor prevalencia en España desde hace años es el cucumber mottle mosaic virus o CGMMV, un virus que afecta principalmente a pepino y que provoca grandes pérdidas económicas debido a que genera deformidades en el fruto. Es un virus que se transmite principalmente por semillas o mecánicamente, por lo que resulta muy difícil de eliminar. Comprender en profundidad la naturaleza de este virus puede ayudar a controlar futuras infecciones. Las infecciones virales provocan cuantiosas pérdidas económicas, por lo que el uso combinado de unas buenas estrategias de control es importante para reducir las pérdidas asociadas a este tipo de etiologías. Un diagnóstico temprano es crucial para frenar la expansión de nuevos virus. En los últimos años, la detección simultanea de virus mediante la hibridación molecular no radiactiva ha demostrado ser una técnica, rápida, sencilla y que puede ser incorporada para su uso rutinario. Aunque esta técnica tiene sus limitaciones, los resultados obtenidos son altamente atractivos para su uso en la detección de las principales etiologías de origen vira y/o viroidal de un cultivo. En este trabajo se generaron 17 sondas individuales y 3 polisondas capaces de detectar los principales virus que afectan a cucurbitáceas en España. Tanto las sondas individuales como las polisondas demostraron gran sensibilidad y especificidad al hibridar con sus controles positivos, presentando límites de detección del orden de picogramos de RNA viral por microlitro de RNA total. Las hibridaciones llevadas a cabo con muestras de RNA de cucurbitáceas infectadas demostraron que el uso de polisondas era igual de efectivo que el de las sondas individuales a la hora de identificar positivos. En el presente trabajo también se ha analizado la posibilidad de aumentar el limite de detección de las polisondas mediante reducción de la temperatura de hibridación y/o la duplicación de los fragmentos introducidos observándose resultados prometedores para incrementar la sensibilidad de esta tecnología. Por otra parte, también se consiguió la obtención del clon infeccioso del aislado 307/17 de CGMMV. Pese a la ausencia de síntomas en plantas de N. benthamiana, se confirmó la presencia del virus mediante RT-PCR, aunque con un bajo nivel de acumulación. Esto sugiere que el aislado 307/17 genera una infección residual en esta especie. Además, el genoma de este aislado fue secuenciado en su totalidad, lo cual permitió realizar estudios de filogenia, que concluyeron que el aislado secuenciado pertenecía al subgrupo formado por aislados europeos, tal y como indicaban los análisis previamente realizados.

[EN] [EN] The cultivation of cucurbits such as cucumber, watermelon, melon and courgette is of great economic importance both at a global and national level. The production of these crops has increased significantly in recent years and with it, the arrival of viruses and/or viral vectors to new geographical regions. One of the viruses that has been more prevalent in Spain for years is the cucumber mottle mosaic virus or CGMMV, a virus that mainly affects cucumber and causes great economic losses due to the deformities it generates in the fruit. It is a virus that is mainly seed-borne or mechanically transmitted, making it very difficult to eliminate. A thorough understanding of the nature of this virus can help to control future infections. Viral infections cause heavy economic losses, so the combined use of good control strategies is important to reduce losses associated with these aetiologies. Early diagnosis is crucial to stop the spread of new viruses. In recent years, simultaneous virus detection by non-radioactive molecular hybridisation has proven to be a rapid, simple technique that can be incorporated for routine use. Although this technique has its limitations, the results obtained are highly attractive for use in the detection of the main aetiologies of vira and/or viroidal origin in a culture. In this work, 17 individual probes and 3 polyprobes capable of detecting the main viruses affecting cucurbits in Spain were generated. Both the individual probes and the polyspindles showed high sensitivity and specificity when hybridised with their positive controls, presenting detection limits in the order of picograms of viral RNA per microlitre of total RNA. Hybridisations carried out with RNA samples from infected cucurbits showed that the use of polyprobes was as effective as that of individual probes in identifying positives. In the present work, the possibility of increasing the detection limit of the polyprobes by reducing the hybridisation temperature and/or duplicating the introduced fragments has also been analysed, with promising results to increase the sensitivity of this technology. On the other hand, it was also possible to obtain the infectious clone of CGMMV isolate 307/17. Despite the absence of symptoms in N. benthamiana plants, the presence of the virus was confirmed by RT-PCR, although with a low level of accumulation. This suggests that isolate 307/17 generates residual infection in this species. In addition, the genome of this isolate was sequenced in its entirety, which allowed phylogeny studies to be carried out, concluding that the sequenced isolate belonged to the subgroup formed by European isolates, as indicated by the analyses previously carried out.