Comparación de sistemas de edición genética y edición de bases basados en la tecnología CRISPR/Cas9 y CRISPR/Cas12

Abstract

[ES] El hecho de que los caracteres agronómicos de interés dependan de variaciones en uno o unos pocos nucleótidos hace especialmente interesante el diseño de sistemas de edición génica para su aplicación en plantas. Es por ello, que en el presente proyecto se persigue la creación de este tipo de sistemas de edición de bases que aúnan, en una proteína de fusión, la especificidad, dada por los complejos Cas-RNA guía de los sistemas CRISPR/Cas9 y CRISPR/Cas12, y la capacidad de editar bases, procedente de enzimas capaces de modificar las bases del DNA. Estos sistemas deben ser fáciles de construir y eficaces para el objetivo dado. En este punto es clave la Biología Sintética que permite la creación y diversificación de este tipo de sistemas al crear módulos funcionales ensamblables e intercambiables y sistemas para el ensamblaje sencillo de estos módulos. Sin embargo, la monitorización de los cambios producidos por los sistemas de edición es aún un reto, lo que limita su desarrollo y optimización. En este contexto se plantea el presente Trabajo de Fin de Máster, en el que se generan editores de bases y editores génicos basados en los sistemas bacterianos CRISPR/Cas9 y CRISPR/Cas12 empleando los editores A3A-PBE y ABE8e. Los sistemas de edición de bases creados son evaluados empleando gRNAs que los dirigen la maquinaria de edición a distintos genes. Así se consigue evaluar su eficiencia demostrando la funcionalidad de sistemas de edición A3A-dCas12, ABE8e-nCas9 y ABE-dCas9, tanto con Cas intronizadas como con Cas sin intronizar. Con estos resultados se verifica la posibilidad de crear editores de bases de alta eficiencia en plantas basados en Cas12 y se determinan cuales las versiones de las proteínas Cas más apropiadas para la construcción de estos sistemas. En paralelo, se sientan las bases para la creación de un sistema reportero, basado en la ruta de bioluminiscencia de N. nambi, que permita cuantificar la eficiencia de editado genético en plantas.

[EN] The fact that agronomic traits of interest depend on variation in one or a few nucleotides makes the design of gene editing systems for their application in plants particularly interesting. Therefore, the present project aims to create this type of base editing systems that combine, in a fusion protein, the specificity, from Cas-RNA guide complexes of the CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12 systems, and the ability to edit bases, from enzymes that modify DNA bases. These systems should be easy to construct and effective for the given objective. At this point, Synthetic Biology plays a key role, enabling the creation and diversification of such systems by generating functional modules that are assembleable and interchangeable, along with systems for the simple assembly of these modules. However, monitoring changes induced by editing systems remains a challenge, limiting their development and optimization. In this context, the present Master Thesis is proposed, in which base editors and gene editors based on bacterial CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12 systems are generated using A3A-PBE and ABE8e editors. The base editing systems created are evaluated using gRNAs that target the editing complexes to different genes. Thus, their efficiency is evaluated and the functionality of A3A-dCas12, ABE8e-nCas9 and ABE-dCas9 editing systems is confirmed, for both intronized Cas and no-intronized Cas. These results verify the possibility of creating highly efficient Cas12-based base editors in plants and determine which versions of Cas proteins are most appropriate for the construction of these systems. In parallel, we laid the foundations for the creation of a reporter system, based on the bioluminescence pathway of N. nambi, that allows quantifying the efficiency of gene editing in plants.