Engineering autobioluminescence in plants using virus-derived replicative vectors.

Abstract

[ES] La expresión transgénica de la Ruta de Bioluminiscencia Fúngica (FBP), constituida por los genes C3H, Luz y CPH, en plantas, representa un avance innovador en la biología de plantas, permitiendo la emisión autónoma y continua de luz. FBP surge como una herramienta prometedora para reemplazar los métodos actuales de reporte de luminiscencia en plantas, cuya principal limitación radica en la necesidad de aplicar sustrato exógeno. Sin embargo, esta vía se encuentra en sus primeras etapas y está abierta a la optimización para lograr una mayor emisión de bioluminiscencia.

En este estudio, se propusieron sistemas replicativos virales para mejorar la producción de transcritos (ganancia transcripcional) de los genes de FBP, con el fin de potenciar la emisión de bioluminiscencia y descubrir pasos limitantes en la vía. Se emplearon dos vectores virales deconstruidos para este propósito: uno basado en la replicación de ADN del geminivirus, llamado geminino, y otro utilizando la replicación de ARN de TMV, llamado dTMV. Desafortunadamente, ni el gen limitante de la vía, la hispidina sintasa (HispS), ni los demás genes demostraron niveles de expresión aumentados con estos vectores virales en comparación con el sistema estándar de expresión no replicativa. Como alternativa, se seleccionaron tres hispidina sintasas derivadas de plantas (HmS, ASCL, PKS2), más compactas que la HispS fúngica, para reemplazar la HispS en la FBP y probar su potencial para producir mayor bioluminiscencia. No se informó de una mejora en la luminiscencia al utilizar las hispidinas de plantas en lugar de HispS. Sin embargo, la luminiscencia generada por las hispidinas de plantas mostró un aumento significativo al expresar estas hispidinas a través del sistema de expresión dTMV en comparación con el sistema de expresión no replicativa, un comportamiento que no se observó al expresar los genes de FBP a través de los vectores virales. Esto podría indicar que hay margen para obtener una ganancia transcripcional con los sustitutos de plantas. Específicamente, HmS produjo la mayor emisión de luminiscencia entre las tres hispidinas de plantas, destacándose como el sustituto de HispS más prometedor. Esto ofrece potencial para una mayor optimización y la búsqueda de valores máximos, alimentando la esperanza de futuros éxitos con sistemas virales replicativos.

Al mismo tiempo, se exploró la aplicabilidad de FBP como un biomarcador para rastrear la infección viral. La inserción del gen HmS en el genoma de un virus PVX permitió el seguimiento de la infección sistémica de PVX en una planta que expresaba los genes complementarios de FBP C3H, Luz y CPH. HmS clonado en un virus TMV también permitió un análisis en profundidad del movimiento de célula a célula de TMV. Se observaron patrones de infección espaciotemporales de los virus a través de la expresión de biomarcadores luminiscentes en hojas y plantas enteras. La aplicación de FBP dentro de estos vectores virales sienta las bases para futuras investigaciones sobre los movimientos de partículas virales y su papel como bioindicadores en plantas centinela.

[EN] The transgenic expression of the Fungal Bioluminescence Pathway (FBP), constituted by, C3H, Luz, and CPH genes, in plants, represents a groundbreaking advancement in plant biology, enabling autonomous and continuous light emission. FBP emerges as a promising tool to replace current luminescence reporter methods in plants, whose main limitation lies in the need for exogenous substrate application. However, this pathway is in its early stages and is open to optimization for achieving increased bioluminescence emission. In this study, viral replicative systems were proposed to enhance the production of transcripts (transcriptional gain) of FBP genes, to enhance bioluminescence emission, and uncover limiting steps in the pathway. Two deconstructed viral vectors were employed for this purpose: one based on DNA replication of the geminivirus, named geminino, and another utilizing RNA replication of TMV, called dTMV. Unfortunately, neither the pathway-limiting gene, hispidin synthase (HispS), nor the remaining genes demonstrated increased expression levels with these viral vectors compared to the standard non-replicative expression system. Alternatively, three plant-derived hispidin synthases (HmS, ASCL, PKS2), more compact than the fungal HispS, were chosen to replace HispS in the FBP and test their potential for producing greater bioluminescence. An improvement in luminescence was not reported by using the plant hispidins instead of HispS. However, the luminescence yielded by the plant hispidins showed a significant increase when expressing these hispidins through the dTMV expression system compared to the non-replicative expression system, a behaviour that was not reported when expressing the FBP genes through the viral vectors. This could indicate that there is room for transcriptional gain with the plant substitutes. Specifically, HmS produced the higher luminescence emission among the three plant hispidins, emerging as the most promising HispS substitute. This offers potential for further optimization and the pursuit of peak values, fostering hope for future success with replicative viral systems. At the same time, the applicability of the FBP as a biomarker for tracking viral infection was explored. Insertion of the HmS gene in the genome of a PVX virus enabled the tracking of the systemic infection of PVX in a plant expressing the complementary FBP genes C3H, Luz, and CPH. HmS cloned in a TMV virus also allowed to follow in-depth analysis of cell-to-cell movement of TMV. Spatiotemporal infection patterns of the viruses were observed through the expression of the luminescent biomarkers in leaves and entire plants. The application of FBP within these viral vectors lays the basis for future research on viral particle movements and their role as bioindicators in sentinel plants.