Efecto del apareamiento de los nucleótidos del precursor shc-MIR390 sobre la acumulación de microRNAs artificiales derivados del mismo

Abstract

[ES] El silenciamiento génico mediado RNA o RNA de interferencia (RNAi) es un mecanismo de regulación de la expresión génica tanto en células animales como vegetales. El RNAi está mediado por pequeños RNAs (sRNAs) no codificantes que se unen mediante complementariedad de bases con sus transcritos diana. Entre los diferentes tipos de sRNAs destacan los microRNAs (miRNAs), con un tamaño aproximado de 21 nucleótidos (nt). La explotación de la ruta de biogénesis de estas moléculas en plantas ha dado lugar a una serie de herramientas biotecnológicas con las que producir miRNAs artificiales (amiRNAs) a partir de precursores de miRNAs endógenos para silenciar genes de interés. De los diversos precursores endógenos utilizados, el At-MIR390a de Arabidopsis thaliana ha sido uno de los más empleados para la producción de amiRNAs debido a su tamaño relativamente pequeño (521 nt). Recientemente, con el fin de abaratar los costes de producción de amiRNAs a gran escala en bacterias y estabilizar su expresión a partir de vectores virales, se ha diseñado un precursor mínimo, el shc-MIR390, con una considerable reducción de tamaño a solo 89 nt. Por otro lado, se sabe que en la estructura secundaria de los precursores de miRNAs de plantas los apareamientos son las interacciones más frecuentes. Esto, junto con la identidad de los nucleótidos que forman los apareamientos y desapareamientos de la estructura influye en la acumulación de los miRNAs y, por tanto, en el grado de silenciamiento inducido. En este Trabajo Fin de Máster se ha explorado el efecto de aparear individualmente los nucleótidos que están desapareados en el precursor mínimo shc-MIR390 sobre la acumulación de amiRNAs. Con este objetivo se han generado diversas construcciones para producir amiRNAs contra los genes SULPHUR (NbSu) y CLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (NbClaI) de Nicotiana benthamiana a partir de las diferentes variantes del precursor shc-MIR390 e inducir el amarilleamiento del tejido silenciado en experimentos de expresión transitoria en N. benthamiana. Los análisis fenotípicos y moleculares muestran que el apareamiento de la posición 18/73 del precursor mínimo shc-MIR390, coincidente con el sitio de corte de DCL1, provoca un aumento de la acumulación de amiRNAs independientemente de la secuencia del amiRNA utilizado. Además, la identidad de los nucleótidos que forman el apareamiento en esta posición influye en la acumulación de los amiRNAs, siendo los apareamientos G18-C73 y C18-G73 los que permiten alcanzar los mayores niveles.

[EN] RNA-mediated gene silencing or RNA interference (RNAi) is a mechanism for regulating gene expression in both animal and plant cells. RNAi is mediated by small non-coding RNAs (sRNAs) that bind to high complementary target transcripts. Among the different types of sRNAs, microRNAs (miRNAs), with an approximate size of 21 nucleotides (nt), stand out. Exploiting the biogenesis pathway of these molecules in plants has given rise to a number of biotechnological tools to produce artificial miRNAs (amiRNAs) from endogenous miRNA precursors in order to silence genes of interest. From the various endogenous precursors used, At-MIR390a from Arabidopsis thaliana has been one of the most widely used for amiRNA production due to its relatively small size (521 nt). Recently, in order to reduce the cost of large-scale production of amiRNAs in bacteria and to stabilize their expression from viral vectors, a minimal precursor, shc-MIR390, has been designed with a considerable reduction in size to only 89 nt. On the other hand, it is known that in the secondary structure of plant miRNA precursors, base pairs are the most frequent interactions. This, together with the identity of the nucleotides in paired positions and mismatches of the precursor structure, influences the accumulation of miRNAs and thus the degree of induced silencing. In this Master Thesis we have explored the effect on amiRNA accumulation of individually base-pairing the mismatched nucleotides present in the minimal precursor shc-MIR390. For this purpose, several constructs have been generated to produce amiRNAs against the SULPHUR (NbSu) and CHLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (NbClaI) genes of Nicotiana benthamiana from different variants of the shc-MIR390 precursor to induce yellowing of the silenced tissue in transient expression experiments in N. benthamiana. Phenotypic and molecular analyses show that pairing 18/73 position of the minimal precursor shc-MIR390, corresponding with the DCL1 cleavage site, leads to increased accumulation of amiRNAs in a sequence-independent manner. Furthermore, the nucleotide identity of base-pair at this position influences the accumulation of amiRNAs, with the G18-C73 and C18-G73 pairs reaching the highest levels of amiRNA accumulation.