Involvement of the Melanocortin System in the Regulation of Circadian and Behavioural Mechanisms in Zebrafish

Abstract

[ES] El sistema de melanocortina es una estructura clave en la regulación de una amplia gama de funciones fisiológicas que incluyen la melanogénesis, la respuesta al estrés y el equilibrio energético, mediante la unión a una familia de receptores acoplados a la proteína G específicos (MC1R-MC5R). La sobreexpresión de agonistas inversos, la proteína de señalización agutí (Asip) y la proteína relacionada con agutí (Agrp) da como resultado un aumento de la ingesta de alimentos, de crecimiento lineal y de peso corporal. Asip regula la polaridad de pigmentación dorsoventral a través del MC1R, y la sobreexpresión induce obesidad en ratones al unirse al Mc4r central. La sobreexpresión de asip1 en el pez cebra transgénico (asip1-Tg) mejora el crecimiento, sin afectar la acumulación lipídica (obesidad), incluso cuando se alimentan bajo regímenes inductores severos. Los peces asip1-Tg no necesitan comer más para crecer más y más rápido, lo que sugiere una mayor eficiencia alimentaria. Además, los peces asip1-Tg criados en alta densidad son capaces de crecer mucho más que los peces de tipo salvaje (WT) criados en baja densidad, aunque los peces asip1-Tg parecen ser más sensibles al estrés por hacinamiento que los peces WT. El análisis transcriptómico comparativo del intestino de asip1-Tg refleja una expresión diferencial de transportadores aminoácidicos, monocarboxilatos, transportadores iónicos y de vitaminas. La sobreexpresión reduce la integridad del epitelio intestinal aumentando su permeabilidad paracelular y potencia el transporte electrogénico de aminoácidos. Así, los peces transgénicos poseen mayor capacidad para la absorción de nutrientes y, por extensión una mejora en la eficiencia alimenticia que podría explicar, en parte, ese crecimiento diferencial bajo tasas de ingesta similares. Esta tesis tuvo también como objetivo investigar si los asip1-Tg mantienen un fenotipo dominante asociado con una mayor tasa de alimentación. Los resultados muestran, por el contrario, un carácter reactivo/subordinado en los asip1-Tg que aboga por una participación del sistema de melanocortinas en la regulación del comportamiento de peces. El perfil subordinado de los animales asip1-Tg, junto con una activación del eje del estrés, sugiere que estos animales pueden mostrar un comportamiento de ansiedad. Los resultados indicaron que los peces asip1-Tg muestran un comportamiento de ansiedad que además relacionado con una severa disminución de los niveles centrales de serotonina (5HT) y dopamina y elevación de su recaptación neuronal y degradación. La administración de un inhibidor de la recaptación de 5HT, recupera el fenotipo comportamental salvaje, mitigando el comportamiento de ansiedad en los peces transgénicos y rescatando los niveles de 5HT. Esta ansiedad podría repercutir en una alteración del comportamiento locomotor de los animales, por ello estudiamos los ritmos circadianos de actividad locomotora. Los resultados muestran que los animales asip1-Tg exhiben una disrupción completa del ritmo de actividad, con una actividad muy elevada, especialmente durante la noche. Esta disrupción es concomitante con una desaparición del ritmo diario de serotonina y melatonina. Además, los resultados muestran una pérdida de ritmos de expresión de genes reloj (per1a y clock1a). La incubación, in vitro, de glándulas pineales con Asip1 produjo una inhibición de la secreción de melatonina replicando los resultados obtenidos in vivo y demostrando un efecto directo de Asip1, sobre la fisiología de la pineal. En esta tesis, se utilizó el pez cebra como modelo para investigar los efectos de la obesidad sobre la ansiedad y la memoria. La obesidad no tuvo ningún efecto sobre la ansiedad, pero produjo una disminución de la memoria a corto plazo, estudiada mediante test de condicionamiento aversivo. Este estudio proporciona, un protocolo fiable para evaluar el efecto de las enfermedades metabólica en la función cognitiva y conductual.

[CA] El sistema de melanocortina és una estructura clau en la regulació d'una ampla gamma de funcions fisiològiques que inclouen la melanogènesi, la resposta a l'estrès i l'equilibri energètic, mitjançant la unió a una família de receptors acoblats a la proteïna G específics (MC1R-MC5R). La sobreexpressió d'agonistes inversos, la proteïna de senyalització agutí (Asip) y la proteïna relacionada con agutí (Agrp) dona com a resultat un augment de la ingesta d'aliments, de creixement lineal i de pes corporal. Asip regula la polaritat de pigmentació dors-ventral a través del MC1R, y la sobreexpressió indueix obesitat en ratolins en unir-se al MC4R central. La sobreexpressió de asip1 en el peix zebra transgènic (asip1-Tg) millora el creixement, sense afectar l'acumulació lipídica (obesitat), inclús quan s'alimenten sota règims inductors severs. Los peces asip1-Tg no necessiten menjar més per a créixer més i més ràpid, lo qual suggereix una major eficiència alimentària. A més a més, els peixos asip1-Tg criats en alta densitat són capaces de créixer molt més que els peixos de tipus salvatge (WT) criats en baixa densitat, malgrat que els peixos asip1-Tg semblen ser més sensibles a l'estrès per amuntegament que els peixos WT. L'anàlisi transcriptòmic comparatiu de l'intestí de asip1-Tg reflecteix una expressió diferencial de transportadors aminoacídics, monocarboxilats, transportadors iònics i de vitamines. La sobreexpressió redueix la integritat de l'epiteli intestinal augmentant la seua permeabilitat paracel·lular i potencia el transport electrogènic d'aminoàcids. Per tant, els peixos transgènics posseeixen major capacitat per l'absorció de nutrients i, per extensió una millora en la eficiència alimentària que podria explicar, en part, eixe creixement diferencial sota taxes d'ingesta similars. Aquesta tesi tingué també com a objectiu investigar si els asip1-Tg mantenien un fenotip dominant associat amb una major taxa d'alimentació. Els resultats mostren, pel contrari, un caràcter reactiu/subordinat en los asip1-Tg que advoca per una participació del sistema de melanocortines en la regulació del comportament de peixos. El perfil subordinat dels animals asip1-Tg, junt amb una activació de l'eix de l'estrès, suggereix que aquests animals poden mostrar un comportament d'ansietat. Els resultats indicaren que els peixos asip1-Tg mostren un comportament d'ansietat relacionat amb una severa disminució dels nivells centrals de serotonina (5HT) i dopamina i elevació de la seua recaptació neuronal i degradació. L'administració de un inhibidor de la recaptació de 5HT recupera el fenotip comportamental salvatge, mitigant el comportament d'ansietat en els peixos transgènics i rescatant els nivells centrals de 5HT. Esta ansietat podria repercutir en una alteració del comportament locomotor dels animals, per la qual cosa vam estudiar els ritmes circadians d'activitat locomotora. Els resultats mostren que els animals asip1-Tg exhibeixen una disrupció completa del ritme d'activitat, amb una activitat molt elevada durant tot el cicle diari, especialment durant la nit. Esta disrupció es concomitant amb una desaparició del ritme diari de serotonina i melatonina. A més a més, els resultats mostren una pèrdua de ritmes de expressió de gens rellotge (per1a y clock1a). La incubació, in vitro, de glàndules pineals con Asip1 va produir una inhibició de la secreció de melatonina replicant els resultats obtinguts in vivo y demostrant un efecte directe de Asip1 sobre la fisiologia de la pineal. En esta tesi, se va utilitzar el peix zebra com a model per investigar els efectes de la obesitat sobre la ansietat i la memoria. L'obesitat no va tindre cap efecte sobre l'ansietat, però va produir una disminució de la memòria a curt termini, estudiada mitjançant tests de condicionament aversiu. Aquest estudi proporciona, un protocol fiable per a avaluar l'efecte de les malalties metabòliques en la funció cognitiva i conductual.

[EN] The melanocortin system plays a key role in the regulation of a wide range of physiological functions including melanogenesis, stress response and energy balance, through binding to a family of specific G protein-coupled receptors (MC1R-MC5R). Overexpression of inverse agonists, agouti-signalling protein (Asip) and agouti-related protein (Agrp) results in increased food intake, linear growth and body weight. Asip regulates dorso-ventral pigmentation polarity through MC1R, and over-expression induces obesity in mice by binding to the central MC4R. Overexpression of asip1 in transgenic zebrafish (asip1-Tg) enhances growth, without affecting lipid accumulation (obesity), even when fed under severe inducing regimens. The asip1-Tg fish do not need to eat more to grow bigger and faster, suggesting increased feed efficiency. In addition, asip1-Tg fish reared at high density are able to grow much larger than wild-type (WT) fish reared at low density, although asip1-Tg fish appear to be more sensitive to overcrowding stress than WT fish. Comparative transcriptomic analysis of asip1-Tg gut reflects differential expression of amino acid, monocarboxylate, ionic and vitamin transporters. Overexpression reduces the integrity of the intestinal epithelium by increasing its paracellular permeability and enhances electrogenic amino acid transport. Thus, transgenic fish possess a greater capacity for nutrient absorption and, by extension, an improvement in feed efficiency that could explain, in part, this differential growth under similar intake rates. This thesis also aimed to investigate whether asip1-Tg maintain a dominant phenotype associated with a higher feeding rate. Experimental results show, on the contrary, a reactive/subordinate character in asip1-Tg which argues for an involvement of the melanocortin system in the regulation of fish behaviour. Improving feeding motivation without promoting aggression in fish, thus avoiding the threat to native populations in case of an escape, makes the inhibition of the melanocortin system, through the overexpression of asip1, a feasible target for the development of genetically modified lines. The subordinate profile of the asip1-Tg animals, together with an activation of the stress axis, suggests that these animals may exhibit anxiety-like behaviour. The results indicated that asip1-Tg fish show a behaviour similar to our concept of anxiety related to a severe decrease in central serotonin (5HT) and dopamine levels as well as the elevation of their neuronal reuptake and degradation. The administration of fluoxetine, a serotonin reuptake inhibitor, recovers the wild-type behavioural phenotype, mitigating anxiety behaviour in transgenic fish and restoring central 5HT levels. This anxiety could have repercussions on the locomotor behaviour of the animals, so we studied circadian rhythms of locomotor activity. The results show that asip1-Tg animals exhibit a complete disruption of the activity rhythm, with very high activity levels throughout the daily cycle, especially during the night. This disruption is concomitant with a disappearance of the daily rhythm of serotonin and melatonin. In addition, the results show a loss of clock gene expression rhythms (per1a and clock1a). Incubation, in vitro, of pineal glands with Asip1 produced an inhibition of melatonin secretion replicating the results obtained in vivo and demonstrating a direct effect of Asip1 on pineal physiology. In this PhD thesis, zebrafish was used as a model to investigate the effects of overfeeding-induced obesity on anxiety-like behaviour and memory. Obesity had no effect on anxiety, but produced a decrease in short-term memory, studied by means of aversive conditioning tests. This study also provides a reliable protocol for assessing the effect of metabolic diseases on cognitive and behavioural function, supporting zebrafish as a model for cognitive and behavioural neuroscience.