Characterization of Tumor Cells and Immune Microenvironment Interactions in Non Small Cell Lung Cancer. Translational implications

Abstract

[ES] En esta tesis, buscamos profundizar en el estudio del microambiente inmunitario del tumor (TME), lo que resultaría en una mejor caracterización del contexto inmunológico de los pacientes y la búsqueda de nuevos biomarcadores en el cáncer de pulmón. Se emplearon cultivos derivados de pacientes con cáncer de pulmón, y líneas celulares comerciales para ensayos de formación de tumoresferas y condiciones adherentes como control. Se analizó la expresión génica de diversos factores inmunorreguladores, observándose una mayor expresión de la mayoría de ellos en las tumoresferas en comparación con las células adherentes. Junto con la secreción, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 cuando se referencian la proteína o el gen, respectivamente) se seleccionó como la molécula que podría tener una fuerte implicación en la modulación del TME. Los análisis proteicos confirmaron que la GAL3 aumentaba en las tumoresferas de cultivos de adenocarcinoma (ADC) y mostraba patrones de localización y expresión diferencial. Las vesículas extracelulares procedentes de tumoresferas exhibieron niveles altos de LGALS3. Además, revelamos que la GAL3 podría desempeñar un papel crucial como molécula inmunomoduladora en el TME, modulando la inmunosupresión a través de las células T reguladoras (TREGS). Esto se confirmó en muestras tumorales de pacientes, dónde los niveles de expresión altos de LGALS3, se correlacionaron con mayores niveles de TREGS, sugiriendo que los tumores pueden reclutar esta población a través de la GAL3. Posteriormente, se evaluaron los roles pronósticos y diagnósticos de la GAL3 soluble (sGAL3) y otros factores inmunorreguladores (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohorte de 94 pacientes con cáncer de pulmón en estadios tempranos resecables (cohorte test). sFGL1, sGAL3 y su combinación mostraron una eficacia diagnóstica óptima para nuestros pacientes. El análisis de supervivencia demostró que, en la sub-cohorte de ADC, los pacientes con niveles altos de sGAL3 experimentaron una supervivencia libre de recaída (SLR) (p=0,048) y una supervivencia global (SG) más corta (p=0,021), mientras que no se observó ninguna asociación en la sub-cohorte de pacientes con carcinoma de células escamosas. El análisis multivariante indicó que sGAL3 podría ser un biomarcador pronóstico independiente para SLR y SG. La expresión génica de nuestro panel de factores inmunoreguladores también se analizó en un grupo independiente de 661 pacientes de TCGA (cohorte de validación), confirmando el valor pronóstico independiente de LGALS3 en la sub-cohorte de ADC para SLR (p=0,021) y SG (p=0,004). El papel diagnóstico, predictivo y pronóstico de estos factores se evaluó en muestras de plasma en el momento basal (PRE) y en la evaluación de la primera respuesta (FR) en una cohorte de 52 pacientes con cáncer de pulmón en estadio avanzado tratados en primera línea con pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 y su combinación de nuevo ofrecieron una eficacia diagnóstica óptima para esta cohorte de pacientes. Los niveles de sGAL3 en FR y sMICB en PRE y FR se asociaron con un beneficio clínico en toda la cohorte y en la subcohorte de ADC. sCD276 también se asoció con la respuesta global en toda la cohorte y en la sub-cohorte de ADC. sMICB en FR se identificó como un biomarcador independiente para la supervivencia libre de progresión (SLP) en toda la cohorte y para SLP y SG en la sub-cohorte de ADC. Además, sGAL3 en PRE se encontró como un biomarcador independiente para SLP y SG en toda la cohorte y en FR se identificó como biomarcador independiente para SG en la sub-cohorte ADC. Una disminución en los niveles de sGAL3 en los pacientes en tratamiento se asoció con una reducción en la SG en toda la cohorte. En conclusión, nuestros hallazgos proporcionan información diagnóstica, pronóstica y predictiva relevante del rol de la GAL3 y otros factores inmunoreguladores para los pacientes con cáncer de pulmón y sirven como base para el desarrollo de nuevos biomarcadores y terapias.

[CA] En aquest estudi, busquem profunditzar en l'estudi del microambient immunològic del tumor (TME), el que resultaria en una millor caracterització del context immunològic dels pacients i la recerca de nous biomarcadors en el càncer de pulmó. S'utilitzaren cultius de llarg termini establits a partir de pacients amb càncer de pulmó en etapa primerenca, i línies cel·lulars comercials per a assajos de formació de tumorsferes per a l'enriquiment de cèl·lules mares canceroses i condicions adherents com a control. S'analitzà l'expressió gènica de diversos factors immunoreguladors, i es va observar una major expressió de la majoria d'ells en les tumorsferes en comparació amb les cèl·lules adherents. Juntament la secreció, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 quan es fa referència a la proteïna o al gen, respectivament) es va seleccionar com la molècula que podria tindre una forta implicació en la modulación del TME. Els anàlisis proteics van confirmar que la GAL3 augmentava consistentment en les tumorsferes de cultius d'adenocarcinoma de pulmó (ADC) i mostrava patrons de localització i expressió diferencial. Les vesícules extracel·lulars precedents de les tumorspheres també van exhibir nivells alts de LGALS3. Vam revelar que la GAL3 podria jugar un paper crucial com a molècula immunomoduladora expressada i secreta en el TME, modulant la immunosupressió a través de les cèl·lules T reguladores (TREGS). Això es va confirmar en mostres tumorals de pacients amb nivells d'expressió elevats de GAL3, que a més tenien majors nivells de TREGS. Posteriorment, es van avaluar els rols pronòstics i diagnòstics de la GAL3 soluble (sGAL3) i altres factors immunoreguladors (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohort de 94 pacients amb càncer de pulmó en estadi primerenc (cohort de test). sFGL1, sGAL3 i la seua combinació van mostrar una eficàcia diagnòstica òptima en la nostra cohort. A més, l'anàlisi de supervivència de Kaplan-Meier va demostrar en la subcohort de ADC en estadi primerenc, que els pacients amb nivells alts de sGAL3 van experimentar una supervivència lliure de recaiguda (SLR) (p=0,048) i una supervivència global (SG) més curta (p=0,021), però no en la de carcinoma de cèl·lules escamoses. L'anàlisi multivariant va indicar que sGAL3 podria ser un biomarcador independent del pronòstic per a SG i SLR. L'expressió gènica de tots aquests factors immunoreguladors també es va analitzar en un grup independent de 661 pacients de TCGA (cohort de validació), confirmant el valor pronòstic independent de LGALS3 en la subcohort de ADC per a SLR (p=0,021) i SG (p=0,004). El paper diagnòstic, predictiu i pronòstic d'aquests factors immunoreguladors també es va avaluar en el moment basal (PRE) i en l'avaluació de la primera resposta (FR) en una cohort de 52 pacients amb cáncer de pulmó en estadi avançat tractats en primera línia amb pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 i la seua combinació de nou van oferir una eficàcia diagnòstica òptima per als pacients d'aquesta cohort. Els nivells de sGAL3 en FR i sMICB en PRE i FR estaven associats amb un benefici clínic durador en tota la cohort i en la subcohort de LUAD. sCD276 també es va associar amb la resposta global en tota la cohort i en la subcohort de ADC. Un anàlisi de regressió de Cox va identificar sMICB en FR com a biomarcador independent per a la supervivència lliure de progressió (SLP) en tota la cohort i per a SLP i SG en la subcohort de ADC. sGAL3 en PRE es va trobar com a biomarcador independent per a SLP i SG en tota la cohort, i sGAL3 en FR es va identificar com a biomarcador independent per a SG en la subcohort de ADC. Una disminució en FR dels nivells de sGAL3 es va associar amb una reducció en la SG en tota la cohort. En conclusió, els nostres descobriments proporcionen informació rellevant sobre el rol diagnòstic y el pronòstic de la GAL3 y altres factor inmunoreguladors per als pacients amb càncer de pulmó i serveixen com a base per al desenvolupament de nous biomarcadors i teràpies.

[EN] The complex field of immuno-oncology is constantly evolving, driven by cancer heterogeneity and the plasticity of the immune cells participating in this process. In this study we aim to delve deeper into the study of immune tumor microenvironment (TME), which will result in an improved characterization of patient`s immune contexture and the search for new biomarkers in lung cancer. In this thesis, long term patient derived lung cancer cell (PDLCC) and commercial cell lines cultures were employed for sphere-forming assays for cancer stem cells enrichment and adherent conditions for the control counterparts. Gene expression of immune-mediators was analyzed showing that expression levels of most selected genes were higher in tumorspheres compared with the adherent cells counterparts. Together with secretion, Galectin-3 (GAL3 or LGALS3 when protein or gene are referenced, respectively) was selected as the molecule that could have a strong implication in the modulation of TME. Immunoblot, flow cytometry and immunofluorescence analyses confirmed that GAL3 was consistently increased in tumorspheres from lung adenocarcinoma (LUAD) and showed differential localization and expression patterns. Extracelullar vesicles from tumorspheres also exhibited high levels of LGALS3. Next, we revealed that GAL3 could play a crucial role as an immunomodulatory molecule expressed and secreted in the TME, modulating immunosuppression through regulatory T cells (TREGS). This was confirmed in patient's tumor samples, where higher levels of LGALS3 correlated with increased TREGS, suggesting that tumors may be recruiting this population through GAL3. The prognostic and diagnostic roles of soluble GAL3 (sGAL3) and other immune-mediators (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) were evaluated in a cohort of 94 early-stage lung cancer (test cohort). sFGL1, sGAL3 and its combination yielded optimal diagnostic efficacy in our patient's cohort. A Cox regression analysis revealed an association between sGAL3 and prognosis. Kaplan-Meier plots show that, in the early-stage LUAD subcohort, patients with high levels of sGAL3 experienced shorter relapse-free survival (RFS) (p=0.048) and overall survival (OS) (p=0.021), while no such association was observed in the lung squamous cell carcinoma subcohort. Multivariate analysis indicated that sGAL3 could be an independent biomarker of prognosis for OS and RFS. Gene expression of our panel of immunoregulatory mediators was also analyzed in an independent group of 661 patients from TCGA (validation cohort), confirming the independent prognostic value of LGALS3 in the LUAD subcohort for PFS (p=0.021) and OS (p=0.004). The diagnostic, predictive and prognostic role of these immune-mediators was also evaluated in plasma samples at baseline (PRE) and at first response assessment (FR) in a cohort of 52 advanced-stage lung cancer patients treated in first-line with pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 and its combination were also found to have a diagnostic value in this clinical setting. The Mann-Whitney test revealed that sGAL3 at FR and sMICB at PRE and FR were associated with clinical benefit in the entire cohort and in the LUAD subcohort. sCD276 was also associated with objective response in the entire cohort and in the LUAD subcohort. A Cox regression analysis identified sMICB at FR as an independent biomarker for progression-free survival (PFS) in the entire cohort and for PFS and OS in the LUAD subcohort. Furthermore, sGAL3 at PRE was found to be an independent biomarker for PFS and OS in the entire cohort, and sGAL3 at FR was identified as an independent biomarker for OS in the LUAD subcohort. A decreased in the levels of sGAL3 on treatment was associated with reduction of OS in the entire cohort. In conclusion, our findings provide relevant prognostic and predictive information on the role of GAL3 and other immune-mediators for lung cancer patients and served as the basis for developing new biomarkers and therapies.