Understanding Isoform Expression and Alternative Splicing Biology through Single-Cell RNAseq

Abstract

[ES] La introducción de la secuenciación de ARN a nivel de célula única (scRNA-seq) en el ámbito de la transcriptómica ha redefinido nuestro entendimiento de la diversidad celular, arrojando luz sobre los mecanismos subyacentes a la heterogeneidad tisular. No obstante, al inicio de esta tesis, las limitaciones de a esta tecnología obstaculizaban su aplicación en el estudio de procesos complejos, entre ellos el splicing alternativo. A pesar de ello, los patrones de splicing a nivel celular planteaban incógnitas que esta tecnología tenía el potencial de resolver: ¿es posible observar, a nivel celular, la misma diversidad de isoformas que se detecta mediante RNA-seq a nivel de tejido? ¿Qué función desempeñan las isoformas alternativas en la constitución de la identidad celular?

El objetivo de esta tesis es desbloquear el potencial del scRNA-seq para el análisis de isoformas, abordando sus dificultades técnicas y analíticas mediante el desarrollo de nuevas metodologías computacionales. Para lograrlo, se trazó una hoja de ruta con tres objetivos. Primero, se establecieron cuatro requisitos para el estudio de las isoformas mediante scRNA-seq, llevando a cabo una revisión de la literatura existente para evaluar su cumplimiento. Tras completar este marco con simulaciones computacionales, se identificaron las debilidades y fortalezas de los métodos de scRNA-seq y las herramientas computacionales disponibles. Durante la segunda etapa de la investigación, estos conocimientos se utilizaron para diseñar un protocolo óptimo de procesamiento de datos de scRNA-seq. En concreto, se integraron datos de lecturas largas a nivel de tejido con datos de scRNA-seq para garantizar una identificación adecuada de las isoformas así como su cuantificación a nivel celular. Este proceso permitió ampliar las estrategias computacionales disponibles para la reconstrucción de transcriptomas a partir de lecturas largas, mejoras que fueron implementadas en SQANTI3, software de referencia en transcriptómica. Por último, los datos procesados se utilizaron para desarrollar un nuevo método de análisis de co-expresión de isoformas a fin de desentrañar redes de regulación del splicing alternativo implicadas en la constitución de la identidad celular.

Dada la elevada variabilidad de los datos de scRNA-seq, este método se basa en la utilización de una estrategia de correlación basada en percentiles que atenúa el ruido técnico y permite la identificación de grupos de isoformas co-expresadas. Una vez configurada la red de co-expresión, se introdujo una nueva estrategia de análisis para la detección de patrones de co-utilización de isoformas que suceden de forma independiente a la expresión a nivel de gen, denominada co-Differential Isoform Usage. Este enfoque facilita la identificación de una capa de regulación de la identidad celular atribuible únicamente a mecanismos post-transcripcionales. Para una interpretación biológica más profunda, se aplicó una estrategia de anotación computacional de motivos y dominios funcionales en las isoformas definidas con lecturas largas, revelando las propiedades biológicas de las isoformas involucradas en la red de co-expresión. Estas investigaciones culminan en el lanzamiento de acorde, un paquete de R que encapsula las diferentes metodologías desarrolladas en esta tesis, potenciando la reproducibilidad de sus resultados y proporcionando una nueva herramienta para explorar la biología de las isoformas alternativas a nivel de célula única.

En resumen, esta tesis describe una serie de esfuerzos destinados a desbloquear el potencial de los datos de scRNA-seq para avanzar en la comprensión del splicing alternativo. Desde un contexto de escasez de herramientas y conocimiento previo, se han desarrollado soluciones de análisis innovadoras que permiten la aplicación de scRNA-seq al estudio de las isoformas alternativas, proporcionando recursos innovadores para profundizar en la regulación post-transcripcional y la función celular.

[CA] La introducció de la seqüenciació d'ARN a escala de cèl·lula única (scRNA-seq) en l'àmbit de la transcriptòmica ha redefinit el nostre enteniment de la diversitat cel·lular, projectant llum sobre els mecanismes subjacents a l'heterogeneïtat tissular. Malgrat les limitacions inicials d'aquesta tecnologia, especialment en el context de processos complexos com l'splicing alternatiu, els patrons d'splicing a escala cel·lular plantejaven incògnites amb potencial de resolució: és possible observar, a escala cel·lular, la mateixa diversitat d'isoformes que es detecta mitjançant RNA-seq en teixits? Quina funció tenen les isoformes alternatives en la constitució de la identitat cel·lular?

L'objectiu d'aquesta tesi és desbloquejar el potencial del scRNA-seq per a l'anàlisi d'isoformes alternatives, abordant les seues dificultats tècniques i analítiques amb noves metodologies computacionals. Per a això, es va traçar una ruta amb tres objectius. Primerament, es van establir quatre requisits per a l'estudi de les isoformes mitjançant scRNA-seq, amb una revisió de la literatura existent per avaluar-ne el compliment. Després de completar aquest marc amb simulacions computacionals, es van identificar les debilitats i fortaleses dels mètodes de scRNA-seq i de les eines computacionals disponibles. Durant la segona etapa de la investigació, aquests coneixements es van utilitzar per dissenyar un protocol òptim de processament de dades de scRNA-seq. En concret, es van integrar dades de lectures llargues a escala de teixit amb dades de scRNA-seq per a garantir una identificació adequada de les isoformes així com la seua quantificació a escala cel·lular. Aquest procés va permetre ampliar les estratègies computacionals disponibles per a la reconstrucció de transcriptomes a partir de lectures llargues, millores que van ser implementades en SQANTI3, un programari de referència en transcriptòmica. Finalment, les dades processades es van fer servir per a desenvolupar un nou mètode d'anàlisi de coexpressió d'isoformes amb l'objectiu de desentranyar xarxes de regulació de l'splicing alternatiu implicades en la constitució de la identitat cel·lular.

Donada l'elevada variabilitat de les dades de scRNA-seq, aquest mètode es basa en la utilització d'una estratègia de correlació basada en percentils que minimitza el soroll tècnic i permet la identificació de grups d'isoformes coexpressades. Un cop configurada la xarxa de coexpressió, es va introduir una nova estratègia d'anàlisi per a la detecció de patrons de co-utilització d'isoformes que succeeixen de forma independent a l'expressió del seu gen, denominada co-Differential Isoform Usage. Aquest enfocament facilita la identificació d'una capa de regulació de la identitat cel·lular atribuïble únicament a mecanismes post-transcripcionals. Per a una interpretació biològica més profunda, es va aplicar una estratègia d'anotació computacional de motius i dominis funcionals en les isoformes definides amb lectures llargues, revelant les propietats biològiques de les isoformes involucrades en la xarxa de coexpressió. Aquestes investigacions culminen en el llançament d'acorde, un paquet de R que encapsula les diferents metodologies desenvolupades en aquesta tesi, potenciant la reproducibilitat dels seus resultats i proporcionant una nova eina per a explorar la biologia de les isoformes alternatives a escala de cèl·lula única.

En resum, aquesta tesi descriu una sèrie d'esforços destinats a desbloquejar el potencial de les dades de scRNA-seq per a avançar en la comprensió de l'splicing alternatiu. Des d'un context de manca d'eines i coneixement previ, s'han desenvolupat solucions d'anàlisi innovadores que permeten l'aplicació de scRNA-seq a l'estudi de les isoformes alternatives, proporcionant recursos innovadors per a aprofundir en la regulació post-transcripcional i la funció cel·lular.

[EN] In the world of transcriptomics, the emergence of single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) ignited a revolution in our understanding of cellular diversity, unraveling novel mechanisms in tissue heterogeneity, development and disease. However, when this thesis began, using scRNA-seq to understand Alternative Splicing (AS) was a challenging frontier due the inherent limitations of the technology. In spite of this research gap, pertinent questions persisted regarding cell-level AS patterns, particularly concerning the recapitulation of isoform diversity observed in bulk RNA-seq data at the cellular level and the roles played by cell and cell type-specific isoforms.

The work conducted in the present thesis aims to harness the potential of scRNA-seq for alternative isoform analysis, outlining technical and analytical challenges and designing computational methods to overcome them. To achieve this, we established a roadmap with three main aims. First, we set requirements for studying isoforms using scRNA-seq and conducted an extensive review of existing research, interrogating whether these requirements were met. Combining this acquired knowledge with several computational simulations allowed us to delineate the strengths and pitfalls of available data generation methods and computational tools. During the second research stage, this insight was used to design a suitable data processing pipeline, in which we jointly employed bulk long-read and short-read scRNA-seq sequenced from full-length cDNAs to ensure adequate isoform reconstruction as well as sensitive cell-level isoform quantification. Additionally, we refined available transcriptome curation strategies, introducing them as innovative modules in the transcriptome quality control software SQANTI3. Lastly, we harnessed single-cell isoform expression data and the rich biological diversity inherent in scRNA-seq, encompassing various cell types, in the design of a novel isoform co-expression analysis method. Percentile correlations effectively mitigated single-cell noise, unveiling clusters of co-expressed isoforms and exposing a layer of regulation in cellular identity that operated independently of gene expression. We additionally introduced co-Differential Isoform Usage (coDIU) analysis, enhancing our ability to interpret isoform cluster networks. This endeavour, combined with the computational annotation of functional sites and domains in the long read-defined isoform models, unearthed a distinctive functional signature in coDIU genes. This research effort materialized in the release of acorde, an R package that encapsulates all analyses functionalities developed throughout this thesis, providing a reproducible means for the scientific community to further explore the depths of alternative isoform biology within single-cell transcriptomics.

This thesis describes a complex journey aimed at unlocking the potential of scRNA-seq data for investigating AS and isoforms: from a landscape marked by the scarcity of tools and guidelines, towards the development of novel analysis solutions and the acquisition of valuable biological insight. In a swiftly evolving field, our methodological contributions constitute a significant leap forward in the application of scRNA-seq to the study of alternative isoform expression, providing innovative resources for delving deeper into the intricacies of post-transcriptional regulation and cellular function through the lens of single-cell transcriptomics.