Study of Diseases Caused by Diaporthe Amygdali and Oomycetes on Almond Crops

Abstract

[ES] Se desarrolló un ensayo qPCR para la detección y cuantificación de inóculo aéreo de D. amygdali, incluyendo el diseño de un par de cebadores específicos para esta especie. Esta metodología se utilizó para estudiar la dinámica del inóculo de D. amygdali en trampas de esporas colocadas en dos huertos de almendros de diferentes ubicaciones, en dos temporadas de crecimiento. Con los datos climáticos registrados se construyó un modelo Hurdle de dos partes; la primera parte relacionó la presencia o ausencia de ADN de D. amygdali (Bernoulli o cualitativa) y la otra consideró la concentración promedio de ADN del hongo (Gamma o cuantitativa). El efecto de la temperatura estuvo relacionado con la amplitud térmica diaria; los rangos térmicos más amplios redujeron la concentración de ADN, mientras que los rangos térmicos más estrechos aumentaron la detección de ADN. Los días con un promedio de humedad relativa superior al 80% tuvieron un efecto negativo en la concentración de ADN de D. amygdali. Las precipitaciones tuvieron una influencia positiva en ambas partes del modelo, confirmando la contribución de la lluvia en la dispersión del inóculo. Finalmente, la variable velocidad del viento influyó positivamente en ambas partes del modelo, en ambas temporadas de crecimiento. En ensayos de laboratorio, se inocularon ramitas de 25 cultivares de almendro con cuatro aislados de D. amygdali, mientras que las inoculaciones de campo implicaron la inoculación de brotes en crecimiento de cultivares de almendro injertados en el portainjerto 'GF-677', durante cuatro años. En ambos tipos de experimentos, el inóculo consistió en discos de agar con micelio, que se insertaron debajo de la corteza y se midió la longitud de las lesiones causadas por el hongo. Todos los cultivares evaluados mostraron lesiones necróticas en respuesta a D. amygdali, confirmando su susceptibilidad. El análisis de conglomerados clasificó los cultivares como susceptibles o muy susceptibles. Las características agronómicas, como el tiempo de floración y maduración, se vincularon con la susceptibilidad de los cultivares. Los cultivares de floración tardía, muy tardía y de maduración temprana a media, mostraron una alta susceptibilidad. Se realizaron prospecciones entre 2018 y 2020 en seis provincias españolas, para recolectar e identificar oomicetos asociados con síntomas de pudrición de raíz y cuello en almendros. Se obtuvieron un total de 104 aislados de oomicetos procedentes de árboles enfermos, y la secuenciación de la región espaciadora transcrita interna (ITS) identificó especies de diferentes géneros. Phytopythium vexans y Ph. niederhauserii fueron las especies más frecuentes. Las pruebas de patogenicidad en plantas de almendro de un año de edad injertadas en el portainjerto 'Garnem' mostraron síntomas graves, como defoliación, marchitez y muerte regresiva, y algunas plantas murieron cuando se inocularon con Pp. vexans y Ph. niederhauserii. Algunos aislados de Ph. niederhauserii redujeron significativamente el peso seco de las raíces en comparación con el control, pero este efecto no se observó en plantas inoculadas con Pp. vexans. Se evaluó la patogenicidad de 12 especies de oomicetos presentes en el suelo en tres portainjertos híbridos de Prunus utilizados frecuentemente en la cuenca mediterránea. Se realizaron pruebas de patogenicidad con 15 aislados de oomicetos en plantas de portainjertos de 1 año de edad. Noventa días después de la inoculación se evaluaron los síntomas de la enfermedad con una escala de severidad y se calculó el AUDPC y la probabilidad de supervivencia de las plantas inoculadas. Todos los aislados fueron patógenos para las plántulas de los portainjertos y se volvieron a aislar de las lesiones de las raíces. Para cada portainjerto se detectaron grandes diferencias en virulencia entre las diferentes especies de oomicetos y aislados de Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora y Pp. helicoides fueron generalmente los más virulentos.

[CA] Es va desenvolupar un assaig qPCR per a la detecció i quantificació d'inòcul aeri de D. amygdali, inclòs el disseny d'un parell d'encebadors específics per a aquesta espècie. Aquesta metodologia es va utilitzar per estudiar la dinàmica de l'inòcul de D. amygdali en trampes d'espores col·locades en dos horts d'ametllers de diferents indrets en dues temporades de creixement. Es va construir un model Hurdle de dues parts amb les dades climàtiques registrades; la primera part relacionava la presència o absència d'ADN de D. amygdali (Bernoulli o qualitatiu) i l'altra considerava la concentració mitjana d'ADN del fong (Gamma o quantitativa). L'efecte de la temperatura estava relacionat amb l'amplitud tèrmica diària; rangs tèrmics més amplis van reduir la concentració d'ADN, mentre que rangs tèrmics més estrets van augmentar la detecció d'ADN. Els dies amb una mitjana d'humitat relativa superior al 80% van tenir un efecte negatiu en la concentració d'ADN de D. amygdali. Les precipitacions van tenir una influència positiva en ambdues parts del model, confirmant la contribució de la pluja en la dispersió de l'inòcul. Finalment, la variable de velocitat del vent va influir positivament en ambdues parts del model, en ambdues temporades de creixement. En proves de laboratori, es van inocular branquetes de 25 cultivars d'ametller amb quatre aïllats de D. amygdali, mentre que les inoculacions de camp van implicar la inoculació de brots en creixement de cultivars d'ametller empeltats al portaempelt 'GF-677' durant quatre anys. En ambdós tipus d'experiments, l'inòcul consistia en discs d'agar amb miceli, que s'introduïen sota l'escorça i es mesuraven les longituds de les lesions provocades pel fong. Tots els cultivars avaluats van mostrar lesions necròtiques en resposta a D. amygdali, confirmant la seva susceptibilitat. L'anàlisi de conglomerats va categoritzar els cultivars com a susceptibles o molt susceptibles. Els trets agronòmics, com ara els temps de floració i maduració, estaven relacionats amb la susceptibilitat del conreu. Els cultivars de floració tardana, molt tardana i de maduració precoç a mitjana van mostrar una alta susceptibilitat. Entre el 2018 i el 2020 s'han realitzat prospeccions a 6 províncies d'Espanya per recollir i identificar oomicets associats a símptomes de podridura de l'arrel i del coll d'ametllers. Es van obtenir un total de 104 aïllats d'oomicets d'arbres malalts i la seqüenciació de la regió de l'espaiador transcrit intern (ITS) va identificar espècies de diferents gèneres. Phytopythium vexans i Ph. niederhauserii eren les espècies més comunes. Les proves de patogenicitat en plàntules d'ametller d'un any empeltades en el portaempelts 'Garnem' van revelar símptomes greus, com ara defoliació, marciment i mort, amb algunes plantes que van morir quan es van inocular amb Pp. vexans i Ph. niederhauserii. Alguns aïllats de Ph. niederhauserii van reduir significativament el pes sec de les arrels en comparació amb el control, però aquest efecte no es va observar en les plàntules inoculades amb Pp. vexans. Es va avaluar la patogenicitat de 12 espècies d'oomicets del sòl en tres portaempelts híbrids de Prunus d'ús habitual a la conca mediterrània. Es van realitzar proves de patogenicitat amb 15 aïllats d'oomicets en plàntules de portaempelt d'un any. Noranta dies després de la inoculació, es van avaluar els símptomes de la malaltia en una escala de gravetat i es va calcular AUDPC i la probabilitat de supervivència de les plàntules inoculades. Tots els aïllats van ser patògens per a les plàntules de portaempelt i es van tornar a aïllar de les lesions de les arrels. Per a cada portaempelt es van detectar grans diferències de virulència entre les diferents espècies d'oomicets i aïllats de Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora i Pp. helicoides eren en general els més virulents.

[EN] A qPCR assay for the detection and quantification of aerial inoculum of D. amygdali, including the design of a pair of specific primers for this species, was developed. This methodology was used to study the dynamics of D. amygdali inoculum in spore traps placed at two almond orchards from different locations in two growing seasons. A two-part Hurdle model was built with the recorded climatic data; the first part related the presence or absence of D. amygdali DNA (Bernoulli or qualitative) and the other considered the average concentration of DNA of the fungus (Gamma or quantitative). The temperature effect was related to daily thermal amplitude; wider thermal ranges reduced DNA concentration, while narrower thermal ranges increased DNA detection. The days with average relative humidity higher than 80% had a negative effect on the concentration of D. amygdali DNA. Rainfall had a positive influence on both parts of the model, confirming the contribution of precipitation in the dispersal of inoculum. Finally, wind speed variable positively influenced both parts of the model, in both growing seasons. In laboratory tests, twigs from 25 almond cultivars were inoculated with four isolates of D. amygdali, while field inoculations involved the inoculation of growing shoots of almond cultivars grafted onto 'GF-677' rootstock over four years. In both type of experiments, inoculum consisted of agar plugs with mycelium, which were inserted underneath the bark and the lesion lengths caused by the fungus were measured. All evaluated cultivars showed necrotic lesions in response to D. amygdali, confirming their susceptibility. Cluster analysis categorized cultivars as susceptible or very susceptible. Agronomic traits, such as blooming and ripening times, were linked to cultivar susceptibility. Late blooming, very late blooming, and early to medium ripening cultivars exhibited high susceptibility. Surveys were carried out between 2018 and 2020 in 6 provinces of Spain to collect and identify oomycetes associated with root and crown rot symptoms on almond trees. A total of 104 oomycete isolates were obtained from diseased trees, and sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) region identified species from different genera. Phytopythium vexans and Ph. niederhauserii were the most common species. Pathogenicity tests on one-year-old almond seedlings of 'Garnem' rootstock revealed severe symptoms, including defoliation, wilting, and dieback, with some plants dying when inoculated with Pp. vexans and Ph. niederhauserii. Some isolates of Ph. niederhauserii significantly reduced the dry weight of the roots compared with the control, but this effect was not observed in seedlings inoculated with Pp. vexans. Pathogenicity of 12 soil-borne oomycete species on three commonly used Prunus hybrid rootstocks in the Mediterranean Basin was evaluated. Pathogenicity tests with 15 oomycete isolates were conducted on 1-year-old rootstock seedlings. Ninety days after inoculation, disease symptoms were evaluated on a severity scale, and the AUDPC and the survival probability of the inoculated seedlings were calculated. All the isolates were pathogenic to the rootstock seedlings and were re-isolated from root lesions. For each rootstock large differences in virulence were detected among the different oomycete species and isolates of Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora and Pp. helicoides were generally the most virulent.