Genetically modified peripheral neurons transplant aided activity maintenance and secretome modulation: a novel strategy for spinal cord injury treatment

Abstract

[ES] El sistema nervioso forma una red de circuitos neuronales esenciales para la locomoción. El sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) transmite información a los músculos. Mientras el sistema nervioso periférico puede regenerarse, el central tiene una capacidad regenerativa limitada. Por ello, las lesiones en el sistema nervioso central son críticas y a menudo carecen de cura. Una de ellas es la lesión de la médula espinal, una condición devastadora sin tratamiento eficaz. Una lesión interrumpe la entrada supraespinal en la médula espinal, conduciendo a disfunción locomotora debajo de la lesión. La relación alterada entre excitación e inhibición, con un aumento en la inhibición y la limitada regeneración de los tractos neuronales afectados, limitan la función locomotora. Como resultado, puede ocurrir parálisis completa incluso en pacientes con lesiones incompletas.

Esta tesis doctoral define una terapia combinada para tratar la lesión de la médula espinal. Hipotetizamos que, para ayudar a la regeneración de los tractos, un trasplante neuronal periférico (ganglios de la raíz dorsal, DRG) que retiene la capacidad de regeneración puede ser efectivo. Para alterar la inhibición y mejorar la supervivencia del trasplante, se empleó la sobreexpresión del canal de sodio bacteriano, NaChBac. Finalmente, para mejorar la regeneración axonal, utilizamos medicamentos que modulan el citoesqueleto.

En el Capítulo 1, validamos nuestra hipótesis con estudios in vitro. Observamos el efecto de Epothilone B y Blebbistatin en la longitud de las neuritas in vitro. Mientras Blebbistatin aumenta la longitud de las neuritas, la combinación con Epothilone la disminuye. Luego, describimos el efecto de NaChBac en los DRG y las células Neuro-2A. En las DRG, NaChBac aumenta la actividad y secreción de factores neurotróficos, promoviendo la señalización pro-supervivencia y anti-apoptótica en las Neuro-2A. Finalmente, describimos cómo la expresión de NaChBac y Blebbistatin mejora la longitud de las neuritas in vitro.

En el Capítulo 2, evaluamos la supervivencia y eficacia del trasplante de DRG con el tracto corticoespinal, el más importante en la locomoción, en un estudio in vivo. Encontramos una adecuada integración del trasplante en el tejido huésped. La expresión de NaChBac aumenta la supervivencia de las células trasplantadas y mejora la preservación del tracto corticoespinal.

En el Capítulo 3, evaluamos el tratamiento combinado en un escenario de lesión crónica y severa. La combinación del trasplante que expresa NaChBac y Blebbistatin limita la recuperación funcional, mientras que el trasplante que expresa NaChBac mejora significativamente la función locomotora en ratones. Los animales trasplantados con DRGs que expresan NaChBac tenían un aumento de fibras neuronales positivas para tubulina, con mayor preservación de mielina, aunque las fibras descendentes serotonérgicas y corticoespinales no mostraron cambios significativos entre los grupos. El trasplante de DRGs que expresan NaChBac aumentó significativamente el input excitatorio neto, determinado por el aumento de contactos de VGLUT2 y la disminución de VGAT en los somas de las neuronas inmediatamente caudales a las lesiones.

Esta tesis sugiere que el trasplante de DRGs que expresan NaChBac rescata parte de la función motora perdida, manteniendo la actividad neuronal excitatoria caudal a la zona lesionada, destacando la relevancia del mantenimiento de la actividad neuronal como estrategia terapéutica para el rescate funcional de lesiones medulares severas.

[CA] El sistema nerviós forma una xarxa organitzada de circuits neuronals que són essencials per la locomoció. El sistema nerviós central (cervell i la medul·la espinal) rep i transmet informació de manera eficaç que és transmesa pel sistema nerviós perifèric als músculs, que comporta a moviment. El sistema nerviós perifèric té capacitat de regeneració, però el central té limitacions. Per això, les lesions en el sistema nerviós central sovint manquen de cura. Una d'elles és la lesió de la medul·la espinal, una condició debilitant que manca d'una cura eficaç. Una lesió resulta en una interrupció de l'entrada supraespinal en la medul·la espinal i conduïx a una disfunció locomotora. La relació alterada entre excitació i inhibició, un augment en la inhibició, juntament amb la capacitat limitada de regeneració endògena, limiten encara més la funció locomotora. Com a resultat, la paràlisi completa pot ocórrer fins i tot en pacients amb lesions anatòmicament incompletes. En esta tesi, ens centrem en estes idees principals per a definir una teràpia combinada. Hipotetizamos que, per a ajudar a la capacitat limitada de regeneració dels tractes, un trasplantament neuronal perifèric (ganglis de l'arrel dorsal, DRG) que reté la capacitat intrínseca de regeneració pot ser efectiva. Per a alterar la inhibició, millorar la supervivència i integració del trasplantament en els circuits, es va a emprar la sobreexpresió del canal de sodi, NaChBac. Finalment, per a dirigir i millorar la regeneració axonal, utilitzem medicaments que modulen el citoesquelet per a millorar la longitud axonal. Esta tesi estudia els efectes d'esta estratègia combinada. En el Capítol 1, estudiem l'efecte sinèrgic dels medicaments que modulen el citoesquelet Epothilone B i Blebbistatin en la longitud de les neurites in vitro i observem que el tractament individual amb Blebbistatin augmenta la longitud dels neurites, la combinació amb Epothilone conduïx a una morfologia del con de creixement alterada que resulta en disminució de la longitud dels neurites. Després, descrivim l'efecte de l'expressió de NaChBac en els DRG i les cèl·lules Neuro-2A. En les DRG, l'expressió de NaChBac conduïx a un augment en l'activitat intrínseca i la secreció de factors neurotrófics, promovent la senyalització pro-supervivència i la senyalització anti-apoptótic en les cèl·lules Neuro-2A. Finalment, descrivim com l'efecte combinat de l'expressió de NaChBac i Blebbistatin millora la longitud dels neurites. En el Capítol 2, avaluem la supervivència i interacció del trasplantament de DRG amb el tracte corticoespinal. Trobem una integració i supervivència adequada del trasplantament. A més, vam mostrar que l'expressió de NaChBac augmenta la supervivència del nombre total de cèl·lules trasplantades, així com millora la preservació del tracte corticoespinal després de la lesió. En el Capítol 3, avaluem l'efecte del tractament combinat en una lesió crònica i severa. Vam demostrar que la combinació del trasplantament que expressa NaChBac i Blebbistatin limita la recuperació funcional, mentres que el trasplantament que expressa NaChBac millora significativament la funció locomotora en ratolins. Per tant, descrivim que els animals trasplantats amb DRGs que expressen NaChBac tenien un augment en la fibra neuronal positiva per a tubulina i la preservació de la mielina, mentres que les fibres descendents serotonérgics i corticoespinales van romandre sense alteració. Trobem que el trasplantament de DRGs que expressen NaChBac va augmentar l'entrada neuronal excitatoria, com es va observar per l'augment en el nombre de contactes de VGLUT2 i la disminució en els contactes de VGAT cabals a les lesions. Així, la tesi suggereix que el trasplantament de DRGs amb NaChBac rescata la funció motora en lesions de la medul·la espinal en retindre una activitat de relé neuronal excitatoria cabal a les lesions en un model sever de lesió i destaca la importància del manteniment de l'activitat com a teràpia efectiva.

[EN] The nervous system forms specialized neuronal circuitry and organization that are essential for locomotion. The central nervous system (brain, spinal cord) receives and relays information, delivered by the peripheral nervous system to muscles to achieve locomotion. It is known that the peripheral nervous system retains its ability to regenerate, the central nervous system has little to no regenerative capacity in adult stages. Therefore, injuries to the central nervous system are critical and lack cure. One such is spinal cord injury; a debilitating condition that lacks an effective treatment. An injury results in severing of supraspinal input into the spinal cord, leading to locomotor dysfunction beneath the injury. Altered excitation inhibition ratio after an injury, increase in inhibition and limited endogenous regeneration capacity of the affected neuronal tracts limit locomotor function. As a result, complete paralysis may occur in patients with anatomically incomplete injuries. In this thesis, we focus on these points to devise a combinatory approach as an effective treatment strategy. We hypothesized that to aid the limited regeneration capacity of the tracts, a peripheral neuronal transplant (dorsal root ganglia, DRG) which retains the intrinsic ability to regenerate can be effective. To overcome inhibition, improve survival and integration of the transplant into circuits, the overexpression of NaChBac sodium channel was employed. Finally, to target and improve the axonal regeneration of endogenous and transplanted cells, we use cytoskeleton modulating drugs to enhance axonal length. This thesis studies the effects of this combinatory approach to treat spinal cord injury.

In Chapter 1, we study the synergistic effect of cytoskeleton modulating drugs Epothilone B and Blebbistatin on neurite length and find that individual treatment with Blebbistatin increases neurite length, combination with Epothilone leads to an altered splayed morphology of the growth cone and decreased neurite length. Next, we describe the effect of NaChBac expression in DRGs and Neuro-2A cells. In DRGs, NaChBac expression leads to an increase in intrinsic activity and secretion of neurotrophic factors, promoting pro-survival signaling and anti-apoptotic signaling in Neuro-2A cells. Finally, we describe the combinatory effect of NaChBac expression and Blebbistatin further improves neurite length in vitro.

In Chapter 2, we evaluate the survival, efficacy, and interaction of the DRG transplant with the corticospinal tract, the most important tract involved in locomotion in a short-term in vivo study. We report a satisfactory integration and survival of the transplant. We also show that NaChBac expression increases the survival of the total number of transplanted cells, as well as improves preservation of the corticospinal tract after the injury.

In Chapter 3, we study the effect of the combinatory treatment in a chronic, severe injury scenario. We find that the combination of the transplant expressing NaChBac and Blebbistatin limits functional recovery, while that of transplant expressing NaChBac significantly improved locomotor function in mice. Therefore, focusing on this, we report that animals transplanted with NaChBac-expressing DRGs had increased tubulin-positive neuronal fiber and myelin preservation, while serotonergic and corticospinal descending fibers remained unaffected. We found that transplantation of NaChBac-expressing DRGs increased the neuronal excitatory input, seen by increased number of VGLUT2 contacts and decrease in VGAT contacts immediately caudal to the injuries. Together, the work in this thesis suggests that the transplantation of NaChBac-expressing dissociated DRGs rescues significant motor function by retaining an excitatory neuronal relay activity immediately caudal to injuries in a severe injury model and highlights the importance of maintenance of activity as an effective therapy for spinal cord injury.