Biomimetic injectable hydrogels of gelatin and hyaluronic acid for hepatic cell culture

Abstract

[ES] La ingeniería tisular hepática ofrece una herramienta propicia de cribado toxicológico y modelización de enfermedades, que también podría proporcionar una terapia alternativa al trasplante de hígado para tratar enfermedades hepáticas en fase terminal. Se han propuesto varios modelos celulares para estudiar la fisiología hepática y el desarrollo de enfermedades. Los sistemas in vitro clásicos se basan en cultivos en monocapa de hepatocitos humanos primarios o líneas celulares de hepatoma, aunque en los últimos años se ha fomentado el uso de sistemas más complejos que también tienen en cuenta la organización tridimensional. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es desarrollar un sistema hepático tridimensional que recapitule la organización tridimensional del hígado utilizando hidrogeles y constructos porosos basados en la matriz extracelular hepática, y su aplicación para el estudio y tratamiento de enfermedades hepáticas. Para ello, primero optimizamos la composición utilizando hidrogeles de gelatina y ácido hialurónico, buscando las propiedades mecánicas más parecidas a las del hígado humano. Para determinar la idoneidad de los hidrogeles desarrollados para el cultivo de células hepáticas, se utilizó la reticulación in situ de células HepG2, una línea celular de hepatoma ampliamente utilizada en Hepatología, y se analizó tanto la viabilidad como la funcionalidad de las células. La caracterización mecánica de los hidrogeles y la evaluación de la funcionalidad de las células HepG2, nos llevaron a seleccionar la composición 20-80 gelatina-ácido hialurónico como la óptima para el cultivo de células hepáticas. En segundo lugar, se prepararon constructos porosos de gelatina-ácido hialurónico con porosidad interconectada y se utilizaron para el cultivo de hepatocitos humanos primarios y la evaluación de las funciones hepáticas clave. Los hepatocitos humanos primarios cultivados en constructos porosos de gelatina-ácido hialurónico mostraron una mayor secreción de albúmina y urea, y una mayor capacidad metabólica (niveles de actividad citocromo P450 y UDP-glucuronosiltransferasa) en comparación con los cultivos en monocapa estándar. El trasplante del constructo poroso con hepatocitos humanos produjo una mejora de la función hepática (niveles de transaminasas, necrosis) y mejoró el daño en un modelo de ratón de insuficiencia hepática inducida por acetaminofeno. Además, el estudio in vivo también proporcionó una comprensión mecanicista de la lesión hepática inducida por acetaminofeno y el impacto del trasplante mediante el análisis de la producción de citoquinas y la inducción de estrés oxidativo para encontrar biomarcadores adecuados de la eficacia de la terapia celular. Finalmente, en la última parte de esta tesis doctoral hemos explorado el uso de la bioimpresión como método para aumentar el rendimiento de los sistemas de ensayo que mejor imitan el entorno y la complejidad del tejido hepático. Para transformar los hidrogeles desarrollados en biotintas, se aumentó el peso molecular del ácido hialurónico. A continuación, se estudió la idoneidad de biotintas híbridas de gelatina y ácido hialurónico mediante la determinación de la viscosidad, la uniformidad y el factor de poros. La bioimpresión de células HepG2 demostró la idoneidad de las biotintas seleccionadas para el cultivo de células hepáticas y la mejora de su producción, lo que sugiere la conveniencia de automatizar y escalar la fabricación de hidrogeles.

[CA] L'enginyeria tissular hepàtica ofereix una ferramenta propícia de cribratge toxicològic i modelització de malalties, que també podria proporcionar una teràpia alternativa al trasplantament de fetge per a tractar malalties hepàtiques en fase terminal. S'han proposat diversos models cel·lulars per a estudiar la fisiologia hepàtica i el desenvolupament de malalties. Els sistemes in vitro clàssics es basen en cultius en monocapa d'hepatòcits humans primaris o línies cel·lulars de hepatoma, encara que en els últims anys s'ha fomentat l'ús de sistemes més complexos que també tenen en compte l'organització tridimensional. L'objectiu principal d'esta Tesi Doctoral és desenvolupar un sistema hepàtic tridimensional que recapitula l'organització tridimensional del fetge utilitzant hidrogels i bastides basades en la matriu extracel·lular hepàtica, i la seua aplicació per a l'estudi i tractament de malalties hepàtiques. Per a això, primer optimitzem la composició utilitzant hidrogels de gelatina i àcid hialurònic, buscant les propietats mecàniques més semblants a les del fetge humà. Per a determinar la idoneïtat dels hidrogels desenvolupats per al cultiu de cèl·lules hepàtiques, es va utilitzar la reticulació in situ de cèl·lules HepG2, una línia cel·lular de hepatoma àmpliament utilitzada en hepatologia, i es va analitzar tant la viabilitat com la funcionalitat de les cèl·lules. La caracterització mecànica dels hidrogels i l'avaluació de la funcionalitat de les cèl·lules HepG2, ens van portar a seleccionar la composició 20-80 gelatina-àcid hialurònic com l'òptima per al cultiu de cèl·lules hepàtiques. En segon lloc, es van preparar bastides de gelatina-àcid hialurònic amb porositat interconnectada i es van utilitzar per al cultiu d'hepatòcits humans primaris i l'avaluació de les funcions hepàtiques clau. Els hepatòcits humans primaris cultivats en bastides de gelatina-àcid hialurònic van mostrar una major secreció d'albúmina i urea, i una major capacitat metabòlica (nivells d'activitat citocrom P450 i UDP-glucuronosiltransferasa) en comparació amb els cultius en monocapa estàndard. El trasplantament de la bastida amb hepatòcits humans va produir una millora de la funció hepàtica (nivells de transaminases, necrosis) i va millorar el mal en un model de ratolí d'insuficiència hepàtica induïda per acetaminofèn. A més, l'estudi in vivo també va proporcionar una comprensió mecanicista de la lesió hepàtica induïda per acetaminofèn i l'impacte del trasplantament mitjançant l'anàlisi de la producció de citocines i la inducció d'estrès oxidatiu per a trobar biomarcadors adequats de l'eficàcia de la teràpia cel·lular. Finalment, en l'última part d'esta tesi doctoral hem explorat l'ús de la bioimpresió com a mètode per a augmentar el rendiment dels sistemes d'assaig que millor imiten l'entorn i la complexitat del teixit hepàtic. Per a transformar els hidrogels desenvolupats en bioimpresions, es va augmentar el pes molecular de l'àcid hialurònic. A continuació, es va estudiar la idoneïtat de la gelatina híbrida i l'àcid hialurònic com biotintes mitjançant la determinació de la viscositat, la uniformitat i el factor de porus. La bioimpresió de cèl·lules HepG2 va demostrar la idoneïtat de les biotintes seleccionades per al cultiu de cèl·lules hepàtiques i la millora del seu rendiment, la qual cosa suggereix la conveniència d'automatitzar i ampliar la fabricació d'hidrogels.

[EN] Liver tissue engineering offers an advantageous toxicological screening and disease-modelling tool and could also provide an alternative therapy to liver transplantation to treat end-stage liver diseases. Several cell-based models have been proposed to study liver physiology and disease development. The classical in vitro systems rely on monolayer cultures of primary human hepatocytes or hepatoma cell lines, although the use of more complex systems that also consider the three-dimensional organization has been encouraged in the last years. The main objective of this PhD Thesis is to develop a three-dimensional hepatic system that recapitulates the three-dimensional organization of the liver using hydrogels and scaffolds based on liver's extracellular matrix composition, and their application for the study and treatment of liver diseases. To this purpose, we first optimized the composition using gelatin-hyaluronic acid hydrogels, looking for the mechanical properties closer to the human liver. In order to determine the suitability of the developed hydrogels for hepatic cell culture, in situ crosslinking of HepG2 cells, a hepatoma cell line widely used in Hepatology, was used and both viability and functionality of the cells were analyzed. Mechanical characterization of hydrogels and the evaluation of HepG2 cells functionality, led us to select the 20-80 gelatin-hyaluronic acid composition as the optimal for hepatic cell culture. Secondly, gelatin-hyaluronic acid scaffolds with interconnected porosity were prepared and used for the culture of primary human hepatocytes and the evaluation of key hepatic functions. Primary human hepatocytes cultured in gelatin-hyaluronic acid scaffolds exhibited increased albumin and urea secretion and metabolic capacity (cytochrome P450 and UDP-glucuronosyltransferase activity levels) compared to standard monolayer cultures. The transplant of the scaffold containing human hepatocytes led to an improvement in liver function (transaminase levels, necrosis) and ameliorated damage in a mouse model of acetaminophen-induced liver failure. Additionally, the in vivo study also provided a mechanistic understanding of acetaminophen-induced liver injury and the impact of transplantation by analyzing cytokine production and oxidative stress induction to find suitable biomarkers of cell therapy's effectiveness. Finally, in the last part of this doctoral thesis we have explored the use of bioprinting as a method for increasing the throughput of the test systems that best mimic the environment and complexity of liver tissue. To transform the developed hydrogels into bioinks, the molecular weight of hyaluronic acid was increased. Then, the suitability of hybrid gelatin and hyaluronic acid as bioinks was studied by determining viscosity, uniformity, and pore factor. Bioprinting of HepG2 cells demonstrated the fitness of the selected bioinks for culturing hepatic cells and improving their performance, suggesting the suitability for automatising and scaling-up hydrogel's manufacturing.